PES1的SUMO化修飾及其相關(guān)功能的研究.pdf

1、Pescadillo(PES1)在生物體的生命活動(dòng)過程中發(fā)揮重要作用，并且在多種生物中具有高度保守性。PES1是維持酵母正常生長(zhǎng)所必須的;在哺乳動(dòng)物中，PES1與上游因子（Upstream binding factor1，UBF1）核糖體的生物合成過程中發(fā)揮協(xié)同作用;小鼠實(shí)驗(yàn)表明，PES1在一些細(xì)胞分裂增殖旺盛的組織中高表達(dá)，說明其可能在細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期中發(fā)揮了作用。此外，PES1在多種癌細(xì)胞中也是高表達(dá)的（如乳腺癌、胃癌和前列腺癌

2、等），表明PES1可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮了重要的作用。
　　SUMO(Small ubiquition related modifier)化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位、穩(wěn)定性及活性等功能。序列分析表明，PES1含有兩個(gè)潛在的SUMO化位點(diǎn)。因此，本文的研究重點(diǎn)是確定PES1的SUMO化修飾，并進(jìn)一步研究SUMO化修飾對(duì)PES1功能的影響，主要內(nèi)容包括:
　　(1)在COS-7細(xì)胞

3、中轉(zhuǎn)染外源的PES1及SUMO，并通過免疫印跡和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證PES1是否能發(fā)生SUMO化修飾，結(jié)果表明PES1可以發(fā)生SUMO化修飾，并且SUMO1、2、3都能發(fā)揮作用，其中SUMO1的作用最強(qiáng)。
　　(2)確定PES1的SUMO化位點(diǎn)，先對(duì)PES1的序列進(jìn)行軟件分析，發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)潛在的SUMO化位點(diǎn)，分別為249位和517位的賴氨酸。然后將其突變，再通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)SUMO化條帶是否產(chǎn)生影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)517位賴氨酸突

4、變后會(huì)使條帶明顯減弱，說明517位的賴氨酸是PES1主要的SUMO化位點(diǎn)。
　　(3) SUMO化修飾通常會(huì)影響蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位及穩(wěn)定性，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)及半衰期實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證SUMO化修飾對(duì)PES1這兩方面的影響，發(fā)現(xiàn)SUMO化修飾不影響PES1的細(xì)胞定位但SUMO化位點(diǎn)突變后會(huì)降低PES1的穩(wěn)定性。
　　(4)對(duì)SUMO化修飾調(diào)控PES1的功能進(jìn)行研究，利用的是熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)，發(fā)先PES1的SUMO化能增