類泛素修飾蛋白Saccharomyces cerevisae Urm1的溶液結(jié)構測定、進化意義分析及功能研究.pdf

1、本論文的工作重點包括S.cerevisiae Urml蛋白的克隆、表達純化并用核磁共振的方法解析了溶液中Urml蛋白的結(jié)構?；诮Y(jié)構，我們分析研究了修飾蛋白與載硫蛋白的進化關系以及Urml修飾體系中Urml與它的活化酶Uba4的相互作用模式。我們作了整個泛素超家族蛋白的結(jié)構比較和結(jié)構聯(lián)配的序列比對。進化分析顯示，Urml是泛素超家族的分子化石，它的結(jié)構和序列可能最好的保守了這個超家族共同祖先蛋白質(zhì)的特征。我們還推測了Urml與Uba4的

2、作用界面。另外，我們還采用蛋白質(zhì)組學方法來分析Urml修飾體系的靶蛋白。 第一章是蛋白質(zhì)修飾體系的簡介，介紹了蛋白質(zhì)修飾體系的分類和生物學功能。目前已發(fā)現(xiàn)的修飾體系有11類，包括：Ubiquitin、NEDDS/Rubl、SUMO、ISG15/UCRP、FAT10、FUB1、UBL5/Hub1、Atg8 and Atg12、Ufm1和Urm1修飾體系。本章重點介紹了Urml修飾體系的研究背景。Urml修飾體系自2000年首次

3、被報道，現(xiàn)在已得到越來越多的關注。已經(jīng)有報道Urml修飾體系在酵母的出芽生殖、營養(yǎng)缺陷時的侵染性生長的形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮功能、參與TOR信號傳導途徑下游通路的調(diào)控和氧化應激反應的調(diào)控。但是目前關于Urml修飾體系功能的研究還主要是通過缺失基因觀察表型，更具體的作用機理和可能還有待進一步的研究發(fā)現(xiàn)。本章還介紹了關于修飾蛋白進化起源的研究。 第二章介紹了分子進化研究的基本理論和研究方法。分子進化鐘與中性理論是分子進化研究的基礎。構建

4、進化樹是研究分子進化的主要手段。構建序列進化樹的步驟包括：1．序列比對建立數(shù)據(jù)模型。2．決定取代模型。3．選擇建樹方法。4．進化樹搜索。5．確定樹根。6．進化樹評估。我們還介紹了蛋白質(zhì)進化的基本特點和蛋白質(zhì)進化關系的識別。 第三章中我們解析了S.cerevisae Urml蛋白的溶液結(jié)構，并分析了其進化意義。從Saccharomyces cerevisae(S288C)菌株染色體中獲取編碼Urml蛋白的基因，構建表達菌株，經(jīng)純

5、化以及同位素標記的預處理，通過核磁共振技術，在計算機軟件輔助下，計算出S. cerevisae Urml蛋白在水溶液中的結(jié)構。Urml的空間結(jié)構是由一個含有五段β-strand的β-sheet和四段α螺旋折疊而成。β-strand以21534的順序組裝成β-sheet曲面。四段螺旋在空間上相互靠近，將β-sheet曲面的凹面封閉，形成一個疏水的核心，包裝成緊湊的球形結(jié)構。α2螺旋內(nèi)側(cè)疏水殘基與β-sheet凹面疏水殘基的疏水相互作用是維

6、持此球形結(jié)構域的主要作用力。α1和α3在空間上相互靠近，可以檢測到它們的遠程NOE。緊隨β4 strand后的四個殘基折疊成小螺旋α4，可以觀察到α2螺旋N末端前的殘基(33-35)與α4螺旋C末端后的幾個殘基(80-83)間的遠程NOE。Urml在C末端的六個殘基構成柔性的尾巴從球形結(jié)構域伸出。結(jié)構相似性比較分析顯示，Urml與ThiS，MoaD的結(jié)構相似程度更高于它與其它修飾蛋白的結(jié)構相似性。Urml的表面靜電，疏水特性也與MoaD

7、的分子表面特征相似，意味著它們可能以相似的方式與配體蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。序列比對和結(jié)構比較的結(jié)果共同支持了修飾蛋白質(zhì)由古老載硫蛋白進化產(chǎn)生的推測，同時為Urml是泛素超家族中的‘分子化石’，即Urml最好的保守了泛素超家族的共有祖先的分子特性的推測提供了重要的證據(jù)。另外，分子表面性質(zhì)分析提示，類似MoaD，Urml通過一個暴露的疏水平臺和平臺周圍一些帶電殘基與配體發(fā)生相互作用。我們相信Urml蛋白結(jié)構的解析為揭示泛素超家族蛋白質(zhì)進化起源

8、提供了重要證據(jù)，同時也為進一步研究修飾蛋白質(zhì)的生理功能和修飾機理提供了新的信息。第四章介紹了我們用蛋白質(zhì)組學方法研究Urml修飾體系靶蛋白的工作進展。首先綜述介紹了蛋白質(zhì)組學概念和研究策略，以及用蛋白質(zhì)組學方法分析修飾蛋白體系靶蛋白的策略和研究進展。我們希望通過蛋白質(zhì)組學方法分析鑒定Urml修飾體系的潛在的靶蛋白，幫助我們更深入的了解Urml修飾體系的生理功能、作用機理。目前我們已經(jīng)成功構建了HisX60-Urml的酵母誘導表達菌株，并