PTEN基因對骨髓基質干細胞來源的神經細胞中細胞骨架構建的影響和意義.pdf

1、目的:
　　本實驗旨在研究在體外人工誘導成人骨髓基質干細胞(BMSC)向有功能的神經細胞分化的生物學過程中，第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因(PTEN)及其下游分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)共同調節(jié)細胞骨架構建特征的變化，同時觀察和探討神經細胞軸突標志性分子微管相關蛋白 tau(MAPT)分布特征及聚集方式，以及分析 MAPT與微絲之間的位置關系，并從機制上探討其在軸突長出過程中的意義。
　　方法:

2、r>　　實驗取材是從成人的松質骨骨髓中分離出基質干細胞，在體外經多種既往證實有效的細胞因子對其誘導分化2周后，經鑒定證實成為具有部分神經功能的神經樣細胞；應用 PTEN抑制劑 BPV作用于該分化的細胞，用半定量RT-PCR方法研究 PTEN下游信號分子 mTOR的表達變化情況；應用結合有綠色熒光劑的鬼筆環(huán)肽(Phalloidin-FITC)這一化學試劑染色細胞中的微絲肌動蛋白（F-actin），顯示細胞骨架構建特征，在熒光顯微鏡下觀察細

3、胞突起內細胞骨架構建的變化特征及測量細胞突起長度。應用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和western blot方法研究 MAPT的表達變化；用結合有熒光劑的鬼筆環(huán)肽化學試劑染色，直接使細胞中微絲肌動蛋白顯示綠色熒光，并聯(lián)合應用免疫熒光細胞化學染色方法使軸突標志蛋白 MAPT顯示紅色熒光，完成雙重染色，進而可以在激光共聚焦顯微鏡下觀察 MAPT和肌動蛋白的定位特征及二者關聯(lián)性。
　　結果:
　　成人骨髓來源的基質干

4、細胞在體外經細胞因子誘導分化后，神經細胞特征性標志分子 NSE和β-III tubulin表達水平增加，而神經干細胞的標志物巢蛋白(nestin)表達先增加后減少(P<0.05)；經 BPV作用后 PTEN的下游分子mTOR的表達水平高于作用前(P<0.05)；細胞突起生長的長度從4.58±1.21μm增加到9.09±2.68μm(P<0.05)。成人骨髓來源的基質干細胞在體外經細胞因子誘導分化后，MAPT的mRNA在基質干細胞向神經細

5、胞分化1周和2周時相對的表達量水平為0.24±0.04和0.52±0.04，與作為對照組的BMSC中表達量水平0.04±0.02比較，表達數量上是逐漸上調的(P<0.05)。MAPT蛋白在分化1周和2周時的相對表達量水平分別為0.18±0.03和0.44±0.05，與對照組中表達量水平0.06±0.02比較也是逐漸上調的(P<0.05)。分化2周后的神經樣細胞通過熒光染色后發(fā)現(xiàn)，經 PTEN抑制劑BPV作用后，MAPT軸突標志分子由彌散

6、分布狀態(tài)轉變?yōu)榫奂癄顟B(tài)，并和細胞微絲產生關聯(lián)，并分布于神經樣細胞一側，此細胞開始出現(xiàn)所謂細胞極化狀態(tài)。
　　結論:
　　在體外，骨髓基質干細胞可以分化成為有功能的神經樣細胞。而且BMSC來源的神經細胞分化成熟時，PTEN/mTOR基因具有調節(jié)神經細胞及其突起內部細胞骨架構建的能力，PTEN參與調節(jié)細胞骨架中神經細胞軸突標志性分子MAPT的表達、轉運和聚集分布過程，為神經細胞的軸突進一步生長和發(fā)育成熟提供物質支持，同時為神經再