PTEN基因?qū)撬杌|(zhì)干細(xì)胞來源的神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞骨架構(gòu)建的影響和意義.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)旨在研究在體外人工誘導(dǎo)成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)向有功能的神經(jīng)細(xì)胞分化的生物學(xué)過程中，第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因(PTEN)及其下游分子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)共同調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架構(gòu)建特征的變化，同時(shí)觀察和探討神經(jīng)細(xì)胞軸突標(biāo)志性分子微管相關(guān)蛋白 tau(MAPT)分布特征及聚集方式，以及分析 MAPT與微絲之間的位置關(guān)系，并從機(jī)制上探討其在軸突長出過程中的意義。
　　方法:

2、r>　　實(shí)驗(yàn)取材是從成人的松質(zhì)骨骨髓中分離出基質(zhì)干細(xì)胞，在體外經(jīng)多種既往證實(shí)有效的細(xì)胞因子對其誘導(dǎo)分化2周后，經(jīng)鑒定證實(shí)成為具有部分神經(jīng)功能的神經(jīng)樣細(xì)胞；應(yīng)用 PTEN抑制劑 BPV作用于該分化的細(xì)胞，用半定量RT-PCR方法研究 PTEN下游信號分子 mTOR的表達(dá)變化情況；應(yīng)用結(jié)合有綠色熒光劑的鬼筆環(huán)肽(Phalloidin-FITC)這一化學(xué)試劑染色細(xì)胞中的微絲肌動(dòng)蛋白（F-actin），顯示細(xì)胞骨架構(gòu)建特征，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)

3、胞突起內(nèi)細(xì)胞骨架構(gòu)建的變化特征及測量細(xì)胞突起長度。應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和western blot方法研究 MAPT的表達(dá)變化；用結(jié)合有熒光劑的鬼筆環(huán)肽化學(xué)試劑染色，直接使細(xì)胞中微絲肌動(dòng)蛋白顯示綠色熒光，并聯(lián)合應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法使軸突標(biāo)志蛋白 MAPT顯示紅色熒光，完成雙重染色，進(jìn)而可以在激光共聚焦顯微鏡下觀察 MAPT和肌動(dòng)蛋白的定位特征及二者關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果:
　　成人骨髓來源的基質(zhì)干

4、細(xì)胞在體外經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化后，神經(jīng)細(xì)胞特征性標(biāo)志分子 NSE和β-III tubulin表達(dá)水平增加，而神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物巢蛋白(nestin)表達(dá)先增加后減少(P<0.05)；經(jīng) BPV作用后 PTEN的下游分子mTOR的表達(dá)水平高于作用前(P<0.05)；細(xì)胞突起生長的長度從4.58±1.21μm增加到9.09±2.68μm(P<0.05)。成人骨髓來源的基質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化后，MAPT的mRNA在基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)

5、胞分化1周和2周時(shí)相對的表達(dá)量水平為0.24±0.04和0.52±0.04，與作為對照組的BMSC中表達(dá)量水平0.04±0.02比較，表達(dá)數(shù)量上是逐漸上調(diào)的(P<0.05)。MAPT蛋白在分化1周和2周時(shí)的相對表達(dá)量水平分別為0.18±0.03和0.44±0.05，與對照組中表達(dá)量水平0.06±0.02比較也是逐漸上調(diào)的(P<0.05)。分化2周后的神經(jīng)樣細(xì)胞通過熒光染色后發(fā)現(xiàn)，經(jīng) PTEN抑制劑BPV作用后，MAPT軸突標(biāo)志分子由彌散

6、分布狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂癄顟B(tài)，并和細(xì)胞微絲產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，并分布于神經(jīng)樣細(xì)胞一側(cè)，此細(xì)胞開始出現(xiàn)所謂細(xì)胞極化狀態(tài)。
　　結(jié)論:
　　在體外，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以分化成為有功能的神經(jīng)樣細(xì)胞。而且BMSC來源的神經(jīng)細(xì)胞分化成熟時(shí)，PTEN/mTOR基因具有調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞及其突起內(nèi)部細(xì)胞骨架構(gòu)建的能力，PTEN參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架中神經(jīng)細(xì)胞軸突標(biāo)志性分子MAPT的表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)和聚集分布過程，為神經(jīng)細(xì)胞的軸突進(jìn)一步生長和發(fā)育成熟提供物質(zhì)支持，同時(shí)為神經(jīng)再