候選食管癌相關(guān)抗原的篩選鑒定及其對(duì)食管鱗癌的診斷價(jià)值.pdf

1、目的：
　　使用血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)（serological proteome analysis，SERPA）篩選、檢索基因組學(xué)與食管鱗癌診斷相關(guān)文獻(xiàn)、系統(tǒng)綜述抗腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigens，TAAs）自身抗體與食管癌診斷相關(guān)研究，回顧總結(jié)本課題組前期研究結(jié)果，鑒定可能的特異性候選食管鱗狀細(xì)胞癌（食管鱗癌，esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）相關(guān)抗原

2、，設(shè)計(jì)并優(yōu)化出可以用于ESCC診斷的抗-TAAs自身抗體組合，構(gòu)建相應(yīng)的ESCC患病預(yù)測(cè)模型，對(duì)所優(yōu)化組合用于ESCC早期診斷的可能性和可行性進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)，并使用一組獨(dú)立的人群樣本資料對(duì)所構(gòu)建的患病預(yù)測(cè)模型的診斷價(jià)值進(jìn)行驗(yàn)證，為建立一種新的食管鱗癌早期體外非侵入性診斷技術(shù)提供依據(jù)和資料。
　　方法：
　　1.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定可能的候選ESCC相關(guān)抗原。
　　1)Western blot方法初步篩選候選ESCC

3、相關(guān)抗原及對(duì)應(yīng)抗體陽性的患者血清：使用102例ESCC患者血清和58例正常對(duì)照血清與食管鱗癌細(xì)胞系TE-2、TE-8、EC1和EC9706全蛋白進(jìn)行Western blot雜交，篩選ESCC患者血清中對(duì)應(yīng)自身抗體陽性率≥10％，并且對(duì)應(yīng)自身抗體在ESCC患者血清中陽性率大于正常對(duì)照血清中陽性率（p＜0.05）的反應(yīng)條帶所對(duì)應(yīng)的蛋白作為可能的候選ESCC相關(guān)抗原，同時(shí)挑選出針對(duì)候選ESCC相關(guān)抗原特異性陽性反應(yīng)的ESCC患者血清。

4、　　2)使用免疫熒光方法進(jìn)一步驗(yàn)證Western blot篩選出來的針對(duì)候選 ESCC相關(guān)抗原呈陽性反應(yīng)的患者血清，并觀察候選腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞學(xué)定位。
　　3)使用SERPA技術(shù)篩選和鑒定候選食管鱗癌相關(guān)抗原：裂解TE-8細(xì)胞株全蛋白，在相同條件下同時(shí)進(jìn)行三根IPG預(yù)制膠條的等電聚焦電泳，SDS-PAGE凝膠電泳后，其中一塊凝膠使用考馬斯亮藍(lán)R250染色，另外兩塊凝膠電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter

5、 membrane，NC膜）后分別與上述挑選出的陽性ESCC患者血清和正常對(duì)照血清進(jìn)行Western blot雜交，雜交后的結(jié)果與考馬斯亮藍(lán)R250染色凝膠進(jìn)行比對(duì)，將血清學(xué)反應(yīng)陽性的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析和鑒定，確定所篩選出候選ESCC相關(guān)抗原的種類和詳細(xì)信息。
　　2.候選TAAs的原核表達(dá)和純化：在基于SERPA方法篩選候選TAAs的基礎(chǔ)上，檢索基因組學(xué)與食管鱗癌相關(guān)文獻(xiàn)，系統(tǒng)綜述抗-TAAs自身抗體與食管癌診斷相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)

6、合本課題組前期相關(guān)研究結(jié)果，對(duì)可能的食管鱗癌候選TAAs進(jìn)行原核表達(dá)和純化。
　　1)候選TAAs原核表達(dá)載體的構(gòu)建：提取EC9706細(xì)胞株總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用特異性PCR引物擴(kuò)增出目的基因，連接入克隆載體后進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析，鑒定正確的目的基因連接入原核表達(dá)載體pET-28a中。
　　2)候選TAAs的原核表達(dá)和純化：將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主表達(dá)菌中，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)濃度，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行可溶性分析。

7、可溶性表達(dá)蛋白使用不同濃度的咪唑進(jìn)行純化，不可溶性表達(dá)蛋白使用不同pH值的8M尿素進(jìn)行純化，并對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。
　　3)純化蛋白的免疫學(xué)活性鑒定：使用特異性抗體與所純化蛋白進(jìn)行Western blot雜交，鑒定所純化蛋白是否具有免疫學(xué)活性。
　　3.候選TAAs自身抗體在ESCC診斷中的價(jià)值評(píng)價(jià)以及ESCC患病預(yù)測(cè)模型的建立與驗(yàn)證。
　　1)單個(gè)抗-TAA自身抗體指標(biāo)對(duì)食管鱗癌的診斷價(jià)值評(píng)價(jià)：采取間接酶聯(lián)免

8、疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法檢測(cè)每種抗-TAA自身抗體在不同研究對(duì)象血清中的相對(duì)表達(dá)量,使用秩和檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較每種抗-TAA自身抗體在ESCC患者組和正常對(duì)照組血清中的表達(dá)量差異；以受試組（包括324例ESCC患者和324例正常對(duì)照）中每個(gè)研究對(duì)象血清中每種抗-TAA自身抗體的表達(dá)含量為自變量，ESCC患病事件作為因變量，采取logistic回歸的方法得出每種

9、抗-TAA自身抗體的表達(dá)與ESCC患病事件的回歸方程并計(jì)算出各個(gè)研究對(duì)象患食管鱗癌的預(yù)測(cè)概率，以預(yù)測(cè)概率=0.5作為截?cái)嘀?，判定每種自身抗體用于診斷ESCC的靈敏度和特異度，受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）分析評(píng)價(jià)每種自身抗體對(duì) ESCC的診斷價(jià)值。將 ESCC患者分為早期 ESCC組（TNM分期為0，I和II期）和晚期ESCC組（TNM分期為III和IV期

10、），統(tǒng)計(jì)并比較各自身抗體指標(biāo)對(duì)不同分期ESCC患者診斷的陽性率，以判定是否具有特異性的早期ESCC相關(guān)抗原指標(biāo)。
　　2)建立ESCC患病預(yù)測(cè)模型：以受試組人群為研究對(duì)象，根據(jù)每個(gè)研究對(duì)象血清中檢測(cè)自身抗體的含量與ESCC患病事件，采用后退（條件）逐步logistic回歸法篩選自變量并構(gòu)建相應(yīng)的預(yù)測(cè)模型，計(jì)算出各個(gè)研究對(duì)象患食管鱗癌的預(yù)測(cè)概率，以預(yù)測(cè)概率=0.5作為截?cái)嘀?，判定患病預(yù)測(cè)模型用于診斷ESCC的靈敏度和特異度，并使用R

11、OC曲線分析評(píng)價(jià)該模型對(duì)受試組中ESCC患者的診斷價(jià)值。逐一剔除納入自變量后對(duì)預(yù)測(cè)模型診斷價(jià)值（包括靈敏度、特異度、AUC以及判定結(jié)果符合率等）貢獻(xiàn)最小的抗-TAA自身抗體指標(biāo)，構(gòu)建新的預(yù)測(cè)模型，并判定所構(gòu)建預(yù)測(cè)模型對(duì)ESCC的診斷價(jià)值，以優(yōu)化抗-TAAs自身抗體組合。
　　3)預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證：以驗(yàn)證組人群（包括186例ESCC患者和186例正常對(duì)照）為研究對(duì)象，將各個(gè)研究對(duì)象對(duì)應(yīng)TAAs自身抗體含量代入上述構(gòu)建預(yù)測(cè)模型中，根據(jù)預(yù)

12、測(cè)概率確定食管鱗癌患病事件，使用ROC曲線分析評(píng)價(jià)構(gòu)建模型在驗(yàn)證組中對(duì)ESCC的診斷價(jià)值。
　　4)所構(gòu)建預(yù)測(cè)模型對(duì)不同分期ESCC患者的診斷：分別評(píng)價(jià)并比較上述構(gòu)建預(yù)測(cè)模型對(duì)受試組和驗(yàn)證組早期ESCC患者和晚期ESCC患者的診斷價(jià)值，以分析預(yù)測(cè)模型是否具有早期ESCC診斷特異性。使用預(yù)測(cè)模型對(duì)研究對(duì)象中所有早期ESCC患者與正常對(duì)照進(jìn)行判定，以預(yù)測(cè)模型從正常人群中區(qū)分出早期ESCC患者的能力，從而進(jìn)一步評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型對(duì)于早期ESC

13、C的診斷價(jià)值。
　　結(jié)果：
　　1.使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定出四種候選的食管鱗癌相關(guān)抗原
　　Western blot方法篩選發(fā)現(xiàn)分子量在40kD、50kD以及65kD附近的三條蛋白條帶的自身抗體在 ESCC患者血清中陽性率明顯高于正常對(duì)照血清；質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示SERPA方法篩選出的候選TAAs分別為hnRNP1A2B1 isform A2（異質(zhì)核核糖核蛋白A2/B1的A2亞型，36kD）、CALR（鈣網(wǎng)蛋白，48

14、kD）、ENO1（烯醇酶-1，47kD）和HSPD1（熱休克蛋白60，61kD）。
　　2.成功構(gòu)建了hnRNPA2B1、CALR、HSPD1和NICD（NOTCH1胞內(nèi)段）四種重組蛋白的原核表達(dá)載體，并成功表達(dá)和純化出這四種候選TAAs重組蛋白，且所純化出的蛋白均具有免疫學(xué)活性。
　　3.對(duì)研究對(duì)象中15種TAAs（hnRNPA2B1、CALR、ENO1、HSPD1、p53、NICD、c-myc、p62/IMP2、MDM2

15、、p90/CIP2A、p16/INK4A、HCCR/LETMD1、IMP1、Koc/IMP3和Cyclin E）自身抗體水平進(jìn)行分析，成功建立起一種基于10種TAAs（p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1、NICD、ENO1、Koc和IMP1）的食管鱗癌患病logistic回歸預(yù)測(cè)模型，該預(yù)測(cè)模型應(yīng)用于受試組研究對(duì)象ESCC診斷的靈敏度為71.6%，特異度為85.2%，AUC為0.871（95%CI：0.8

16、43-0.896），判定結(jié)果符合率為78.4%。對(duì)抗-TAAs自身抗體組合進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，基于9種抗-TAAs抗體組合（p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1、NICD、ENO1和Koc）的預(yù)測(cè)模型用于 ESCC診斷所對(duì)應(yīng)的 AUC最大（AUC=0.872，95%CI：0.844-0.897），而基于7種自身抗體（p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1和NICD）的預(yù)測(cè)模型對(duì)研究對(duì)

17、象是否患病的判定結(jié)果符合率最高（判定結(jié)果符合率為79.2%）。該7種自身抗體預(yù)測(cè)模型對(duì)于受試組食管鱗癌診斷的AUC為0.864，靈敏度為71.9%，特異度為86.4%，對(duì)于驗(yàn)證組食管鱗癌診斷的AUC為0.862，靈敏度為65.6%，特異度為90.3%。與其它組合相比，該7種自身抗體組合具有較高的診斷效能和更高的性價(jià)比，并且該模型能夠較好的從正常人群中區(qū)分出早期 ESCC患者，對(duì)早期 ESCC患者診斷的AUC為0.864，靈敏度為71.9