調(diào)控VEGF與Notch信號通路對胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　骨關(guān)節(jié)炎是一種骨科常見病，在老年人中發(fā)病率較高，其主要病理改變是關(guān)節(jié)軟骨損傷退變。由于軟骨組織是一種無血液供應(yīng)、無神經(jīng)及淋巴組織分布的組織，因此自我修復(fù)能力較差。骨關(guān)節(jié)炎的主要癥狀是關(guān)節(jié)疼痛和活動度受限，影響病人日常生活，甚至導(dǎo)致喪失勞動能力，給家庭和社會造成嚴(yán)重的社會負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。目前治療骨關(guān)節(jié)炎的方法有限，最有效的方法是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。但由于該手術(shù)的花費較高，且不可避免假體松動、下沉等遠(yuǎn)期并發(fā)癥。如能探索出更

2、為簡單有效的治療方法具有良好的社會效益和經(jīng)濟效益。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是一種來源于中胚層的干細(xì)胞，具有多向分化潛能，目前廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)。而應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨組織具有較好的應(yīng)用前景，已有研究顯示關(guān)節(jié)腔注射 MSCs可修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎的軟骨缺損。MSCs治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨缺損的關(guān)鍵是將MSCs分化為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，如果能促進 MSCs軟骨分化則可促進其對軟骨缺損的修復(fù)

3、作用。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（Placenta Derived Mesenchymal Stem Cells，PMSCs）是一種胎盤來源的MSCs。由于其來源于胚胎組織，具有更高的增值活性及分化能力。如果將PMSCs應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的軟骨修復(fù)則能有更好的結(jié)果。
　　有研究顯示在胚胎肢體發(fā)育過程中，抑制血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）表達可促進胚胎干細(xì)胞向軟骨組織分化，而在成

4、體干細(xì)胞中也有研究顯示抑制 VEGF表達可促進其軟骨分化，并能促進干細(xì)胞對骨關(guān)節(jié)炎軟骨缺損的修復(fù)。而在干細(xì)胞軟骨分化過程中有多種信號通路參與調(diào)節(jié)，其中最重要的是Notch信號通路，但其具體作用機制尚未明確。因此本研究設(shè)想主動調(diào)控Notch信號通路，觀察其對PMSCs軟骨分化的影響，尋找出能促進PMSCs軟骨分化的調(diào)控方法。然后采用聯(lián)合調(diào)控VEGF與Notch信號通路的方法促進 PMSCs的軟骨分化，進一步將其運用到內(nèi)側(cè)半月板切除（Des

5、tabilization of the Medial Meniscus，DMM）骨關(guān)節(jié)炎動物模型中，觀察其對軟骨修復(fù)的作用。
　　研究目的
　　首先觀察不同Notch信號通路調(diào)控方式對PMSCs軟骨分化的影響，尋找出能促進PMSCs軟骨分化的調(diào)控方式。然后采用聯(lián)合調(diào)控VEGF與Notch信號通路的方法，觀察其對PMSCs軟骨分化的影響。構(gòu)建小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，將聯(lián)合調(diào)控VEGF與Notch信號通路的PMSCs注射入關(guān)節(jié)腔

6、，觀察其對膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的效果，為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供新的理論支持。本研究分為以下三個部分：
　　第一部分：調(diào)控VEGF與Notch信號通路對PMSCs軟骨分化的影響
　　方法：
　?。?）培養(yǎng) PMSCs，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原 CD29，CD34、CD73、CD90、CD105、CD166的表達。
　?。?）分別應(yīng)用成骨、成脂及成軟骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo) PMSCs分化，觀察其多向分化潛能。堿性磷酸酶染色、茜

7、素紅染色及Runx2、Osteocalcin基因表達水平鑒定其成骨分化能力；油紅O染色，PPARγ、C/EBPa基因表達水平鑒定其成脂分化能力；阿利新藍(lán)染色、II型膠原（Col-II）免疫組織化學(xué)染色及Aggrecan、Col-II及Sox9基因表達水平鑒定其成軟骨分化能力。
　?。?）應(yīng)用VEGF受體抑制劑SU5416抑制VEGF信號通路，觀察其對PMSCs軟骨分化的影響。
　　（4）應(yīng)用Notch信號通路抑制劑 LY41

8、1575抑制 Notch信號通路及 Notch信號通路配體蛋白Jagged1激活Notch信號通路，觀察其對PMSCs軟骨分化的影響。根據(jù)處理方式不同，實驗分為6組：①正常對照組；②Notch7d組：在分化前7天添加Notch信號通路抑制劑LY411575；③Notch21d組：在分化全過程（21天）添加LY411575；④Jag17d組：在分化前7天添加Jagged1蛋白；⑤Jag121d組：在分化全過程添加Jagged1蛋白；⑥Ja

9、g17d+Notch14d組：分化前7天添加Jagged1蛋白+分化后14天添加LY411575。
　?。?）聯(lián)合調(diào)控VEGF與Notch信號通路，觀察其對PMSCs軟骨分化的影響，實驗分為4組：①正常對照組；②VEGFRi組：分化全過程添加VEGF受體抑制劑SU5416；③Jag17d組：分化前7天添加Jagged1蛋白；④VEGFRi+Jag17d組：分化全過程添加SU5416+分化前7天添加Jagged1蛋白。
　　結(jié)

10、果：
　?。?）流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志物結(jié)果顯示，PMSCs表達 CD29、CD73、CD90、CD105、CD166，陽性率分別為100％、100%、100%、54.7%、93.1%，不表達CD34，陽性率為0%。
　　（2）經(jīng)過誘導(dǎo)，PMSCs可成功分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞，證實PMSCs具有多向分化潛能。
　?。?）抑制VEGF信號通路后，Pellet內(nèi)阿利新藍(lán)染色陽性區(qū)域及Col-II蛋白的表達水平比

11、對照組高。軟骨標(biāo)志基因Col-II、Aggrecan、Sox9的表達量較對照組升高。證實抑制VEGF信號通路可促進PMSCs的軟骨分化。
　?。?）應(yīng)用不同方法調(diào)控Notch信號通路后發(fā)現(xiàn)，Notch7d組、Notch21d組與Jag17d+Notch14d組均明顯抑制PMSCs的軟骨分化。Jag121d組的軟骨分化水平與正常組無明顯差異。Jag17d組的PMSCs軟骨分化水平明顯高于對照組。證實早期激活Notch信號通路可促進P

12、MSCs的軟骨分化，而抑制Notch信號通路可明顯抑制其分化，無論抑制時間長短。
　?。?）聯(lián)合調(diào)控VEGF與Notch信號通路后發(fā)現(xiàn)，VEGFRi+Jag17d組的軟骨分化水平高于VEGFRi組與Jag17d組。證實聯(lián)合調(diào)控VEGF信號通路與Notch信號通路對PMSCs的軟骨分化有協(xié)同作用。
　　第二部分：小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型的構(gòu)建
　　方法：
　?。?） DMM手術(shù)操作：取大腿外側(cè)切口，用顯微外科剪沿髕韌

13、帶內(nèi)緣剪開關(guān)節(jié)囊，分離周圍軟組織，完整切除內(nèi)側(cè)半月板。
　　（2）標(biāo)本處理：術(shù)后4周、8周、12周各處死6只模型小鼠，另取6只正常小鼠做對照。解剖雙下肢，福爾馬林固定72小時。固定后脫鈣，之后石蠟包埋、切片。
　?。?）結(jié)果鑒定：H&E染色觀察膝關(guān)節(jié)整體結(jié)構(gòu)，阿利新藍(lán)染色及番紅 O染色觀察膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)情況；OARSI組織學(xué)評分評估各標(biāo)本骨關(guān)節(jié)炎程度；Col-II、Aggrecan免疫組織化學(xué)染色觀察軟骨面內(nèi)基質(zhì)蛋白表達情況

14、；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色觀察脛骨平臺軟骨下骨破骨細(xì)胞活動情況；骨贅大小評分及骨贅成熟度評分分析各組膝關(guān)節(jié)脛骨平臺骨贅形成情況。
　　結(jié)果：
　?。?）膝關(guān)節(jié)組織學(xué)分析：DMM術(shù)后4周小鼠膝關(guān)節(jié)脛骨平臺內(nèi)側(cè)軟骨面已有磨損，但關(guān)節(jié)面尚完整，未見軟骨面破裂，關(guān)節(jié)磨損處軟骨面內(nèi)蛋白多糖含量減少，呈現(xiàn)出早期骨關(guān)節(jié)炎改變。DMM術(shù)后8周時小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺軟骨面磨損較重，軟骨面破裂，關(guān)節(jié)面不完整，殘留軟骨較少，關(guān)節(jié)軟骨面

15、內(nèi)蛋白多糖含量減少，呈現(xiàn)出典型骨關(guān)節(jié)炎改變。DMM術(shù)后12周時小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)間隙磨損嚴(yán)重，脛骨平臺已基本無軟骨殘留，軟骨下骨裸露，脛骨平臺軟骨下骨硬化，呈重度骨關(guān)節(jié)炎改變。
　?。?）DMM術(shù)后4周組的OARSI評分為3±0.6，高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；DMM術(shù)后8周組的OARSI評分為10.8±1.3，明顯高于術(shù)后4周組（P<0.05）；DMM術(shù)后12周的OARSI評分為15.8±1.2，明顯高于術(shù)后8

16、周組（P<0.05）。證實DMM造模手術(shù)的關(guān)節(jié)退變程度呈漸進性發(fā)展。
　?。?）正常膝關(guān)節(jié)軟骨面內(nèi)Col-2及Aggrecan蛋白表達量較高，隨著DMM手術(shù)造模時間的推移，軟骨面內(nèi)Col-2及Aggrecan的蛋白表達量逐漸減少，證實骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時伴有軟骨基質(zhì)蛋白的丟失。
　?。?）DMM造模4周時脛骨平臺軟骨下骨破骨細(xì)胞數(shù)量較多，而在術(shù)后8周時破骨細(xì)胞數(shù)量開始下降，到術(shù)后12周時恢復(fù)至正常水平。
　?。?）DMM術(shù)后

17、4周時可發(fā)現(xiàn)脛骨平臺周圍有骨贅形成，隨著造模時間的推移，骨贅逐漸增大且成熟度逐漸升高。
　　第三部分：調(diào)控VEGF與Notch信號通路對PMSCs修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨缺損的動物實驗研究
　　（1）DMM造模：同第二部分。
　　（2）關(guān)節(jié)腔注射PMSCs：在DMM造模后4周進行關(guān)節(jié)腔注射PMSCs治療，每周注射一次。根據(jù)細(xì)胞處理方法不同分為5組：①Control組：關(guān)節(jié)腔注射培養(yǎng)基；②PMSCs組：關(guān)節(jié)腔注射 PMSCs；③

18、P+V組：關(guān)節(jié)腔注射PMSCs+SU5416；④P+J組：關(guān)節(jié)腔注射PMSCs+Jagged1；⑤P+V+J組：關(guān)節(jié)腔注射PMSCs+SU5416+Jagged1。
　?。?）CM-Dil標(biāo)記追蹤PMSCs：用CM-Dil試劑標(biāo)記PMSCs，追蹤PMSCs注射入關(guān)節(jié)腔后生物活動軌跡。
　?。?）標(biāo)本處理：在關(guān)節(jié)腔注射治療后4周及8周時，每組各處死6只動物，收集雙膝關(guān)節(jié)標(biāo)本。固定后脫鈣，脫鈣14天后石蠟包埋、切片。
　　

19、（5）結(jié)果鑒定：H&E染色觀察膝關(guān)節(jié)整體結(jié)構(gòu)，阿利新藍(lán)染色及番紅 O染色觀察膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)情況；OARSI組織學(xué)評分評估各標(biāo)本骨關(guān)節(jié)炎治療效果；Aggrecan、Col-II、Col-X免疫組織化學(xué)染色觀察修復(fù)軟骨面內(nèi)基質(zhì)蛋白表達情況；脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色觀察膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　?。?）將CM-Dil標(biāo)記的PMSCs注射入DMM小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)，注射后4周時仍可見熒光標(biāo)

20、記的PMSCs，證實PMSCs注射后可長期在關(guān)節(jié)腔內(nèi)存活。
　?。?）膝關(guān)節(jié)組織學(xué)分析：治療4周及8周后發(fā)現(xiàn)，PMSCs組膝關(guān)節(jié)脛骨平臺內(nèi)側(cè)有軟骨修復(fù)，關(guān)節(jié)面尚光滑，未見軟骨破裂，但修復(fù)的軟骨層較薄，軟骨基質(zhì)較少；P+V組與P+J組膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)情況比PMSCs組好，軟骨較厚且軟骨基質(zhì)較多；P+V+J組軟骨修復(fù)效果最好，透明軟骨層較厚，軟骨基質(zhì)染色陽性區(qū)域大且染色較深，明顯優(yōu)于其他各組。OARSI評分也證實了同樣的結(jié)果。
　

21、?。?）PMSCs組修復(fù)的軟骨層內(nèi)可見有Col-2、Aggrecan蛋白表達，但表達量較低，而退變軟骨標(biāo)志蛋白Col-X的蛋白表達量較高，證明PMSCs組修復(fù)的軟骨質(zhì)量較差。P+V組與 P+J組修復(fù)軟骨面的Col-2、Aggrecan蛋白表達量較Control組高，而Col-X的蛋白表達量較Control組低，證實P+V組與P+J組修復(fù)軟骨面的軟骨質(zhì)量較 Control組高。而 P+V+J組修復(fù)軟骨面內(nèi)的Col-2、Aggrecan蛋白

22、表達量比其他組都高，而 Col-X的蛋白表達量比其他組都低，證實P+V+J組修復(fù)軟骨質(zhì)量最高，接近于正常的軟骨組織。
　　（4）PMSCs組的TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)少于Control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），證實關(guān)節(jié)腔注射PMSCs可以抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。P+V組與P+J組的TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于PMSCs組（P<0.05）。而P+V+J組的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于其他組（P<0.05），證實 P+

23、V+J組可以更好的抑制軟骨細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　?。?）PMSCs具有多向分化潛能；抑制VEGF信號通路可以促進PMSCs的軟骨分化；早期激活 Notch信號通路也可以促進其軟骨分化；聯(lián)合調(diào)控 VEGF與Notch信號通路對PMSCs的軟骨分化有協(xié)同作用。
　?。?）DMM手術(shù)可成功構(gòu)建小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，且病變程度呈漸進性發(fā)展，適合用于骨關(guān)節(jié)炎研究。
　?。?）關(guān)節(jié)腔注射 PMSCs對小鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨缺