PLA2G16經(jīng)MAPK通路促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移.pdf

1、研究目的:骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，具有高度肺轉(zhuǎn)移傾向，其5年生存率不足20％。因此，深入了解骨肉瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)骨肉瘤治療意義重大。PLA2G16定義為第XVI磷脂酶A2，前期研究發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)與骨肉瘤患者肺轉(zhuǎn)移及臨床不良預(yù)后相關(guān)，但PLA2G16是如何促進(jìn)轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚未闡明。本研究旨在探討PLA2G16調(diào)控骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)功能及機(jī)制研究。
　　研究方法:
　　1、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Weste

2、rn blot檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞系中PLA2G16的表達(dá)，選擇Saos2和MG63細(xì)胞系進(jìn)行體外細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　2、構(gòu)建慢病毒過表達(dá)PLA2G16的骨肉瘤穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，使用MTT、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室等分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。
　　3、應(yīng)用過表達(dá) PLA2G16載體、小 RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞，改變PLA2G16的表達(dá)后，使用Western blot檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下p-Erk1/2、Erk

3、1/2、p-mTOR、mTOR、p-Akt和Akt等經(jīng)典下游信號(hào)通路表達(dá)情況。
　　4、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)35例骨肉瘤原發(fā)病灶冰凍組織，其中無(wú)轉(zhuǎn)移患者18例，存在肺轉(zhuǎn)移者17例。
　　5、根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用 IHC方法檢測(cè)骨肉瘤組織芯片中88例患者PLA2G16和p-ERK1/2表達(dá)水平，評(píng)價(jià)PLA2G16和p-ERK1/2基因表達(dá)情況與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　研究結(jié)果:
　　1、實(shí)時(shí)熒光定量

4、PCR和Western blot結(jié)果示，HOS細(xì)胞系中PLA2G16表達(dá)量明顯高于 Saos2和 MG63細(xì)胞系。與空白載體對(duì)比，應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)使Saos2和MG63過表達(dá)PLA2G16，可以增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。
　　2、Saos2和MG63細(xì)胞系過表達(dá)PLA2G16，在常規(guī)培養(yǎng)及胎牛血清隔夜饑餓刺激條件下均能明增加ERK1/2磷酸化水平。HOS細(xì)胞系中敲除PLA2G16表達(dá)，相應(yīng)地顯著降低p-Erk1/2表達(dá)水

5、平，提示MAPK的激活是PLA2G16的一個(gè)下游信號(hào)通路。
　　3、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果分析示：轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者原發(fā)病灶中 PLA2G16 mRNA相對(duì)表達(dá)量（均值+標(biāo)準(zhǔn)誤：3.65±0.60）明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移組織樣本（均值+標(biāo)準(zhǔn)誤：2.49±0.69），其均值是非轉(zhuǎn)移組的1.47倍。IHC結(jié)果分析：PLA2G16+與p-ERK1/2+表達(dá)存在相關(guān)性。PLA2G16和p-ERK1/2表達(dá)與骨肉瘤患者肺轉(zhuǎn)移均存在相關(guān)性，但與患者年

6、齡、性別、腫瘤位置及組織分型無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者PLA2G16和p-ERK1/2陽(yáng)性率（75.8% vs41.8%，P=0.002；81.8% vs54.5%，P=0.010）均高于無(wú)轉(zhuǎn)移者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PLA2G16和p-ERK1/2 ROC曲線下面積分別為0.670、0.636，當(dāng)兩基因結(jié)合分析時(shí)ROC曲線下面積為0.706。
　　5、PLA2G16和p-ERK1/2都是骨肉瘤患者OS及MFS

7、預(yù)后因素。當(dāng)二者表達(dá)綜合分析時(shí)，PLA2G16+ p-ERK1/2+組的5年生存率OS(51.1%)和MFS(44.7%)最差，PLA2G16-、p-ERK1/2-(85.4%和85.7%, P=0.020, P=0.016)組生存率預(yù)后最好，PLA2G16-、p-ERK1/2+；PLA2G16+、p-ERK1/2-組5年OS(61.5%)和MFS(54.1%)預(yù)后適中。
　　研究結(jié)論:PLA2G16通過激活MAPK信號(hào)通路增強(qiáng)骨