鈉尿肽C型受體(NPR-C)穩(wěn)定Apoe---小鼠頸動(dòng)脈粥樣斑塊研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　動(dòng)脈粥樣硬化是感染、炎癥、自身免疫等多種因素參與作用的病理過程。本課題提出如下假說:鈉尿肽C型受體基因能夠穩(wěn)定AS斑塊。為解決上述問題，我們構(gòu)建了ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈易損粥樣斑塊模型及過表達(dá)NPR-C的慢病毒，并成功將慢病毒局部轉(zhuǎn)染ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈，同時(shí)設(shè)立生理鹽水對(duì)照組和LV-EGFP空載體組，應(yīng)用病理組織學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，以此闡明NPR-C在ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性中

2、的作用。
　　研究方法:
　　1.ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈易損粥樣斑塊模型構(gòu)建
　　70只8周齡的雄性ApoE-/-小鼠，SPF級(jí)，遺傳學(xué)背景為C57BL/6，給予小鼠充足的水源和食物，保持室內(nèi)恒溫恒濕，12h光照和12h黑暗交替。小鼠適應(yīng)性高脂喂養(yǎng)2周后，給予腹腔麻醉后行右側(cè)頸總動(dòng)脈套管術(shù)。沿著小鼠頸部正中切開皮膚，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，將內(nèi)徑0.30mm，長(zhǎng)度2.5mm頸動(dòng)脈硅膠套管置于右側(cè)頸總動(dòng)脈血管近分叉處外周，細(xì)

3、線固定套管，仔細(xì)縫合皮膚。于小鼠股部肌肉注射青霉素鈉預(yù)防感染，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)5周。
　　2.過表達(dá)NPR-C的慢病毒局部轉(zhuǎn)染小鼠頸動(dòng)脈
　　小鼠行右側(cè)頸總動(dòng)脈套管術(shù)并高脂喂養(yǎng)5周后，施行局部慢病毒轉(zhuǎn)染。將70只小鼠隨機(jī)分成3組:NS組(n=20)、LV-EGFP組(n=20)和LV-NPR-C組(n=30)。小鼠麻醉后，沿頸部正中切開皮膚，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈，暴露血管外膜，將100uL慢病毒稀釋液(2×10^7TU)或者100

4、uLNS通過血管外膜局部浸潤(rùn)到右側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)4周后行安樂死。其中，病毒轉(zhuǎn)染小鼠兩周后從LV-EGFP組隨機(jī)抽取兩只小鼠，行安樂死后用OCT包埋右側(cè)頸動(dòng)脈，制作冰凍切片，并在熒光顯微鏡下觀察頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)熒光情況。
　　3.體重及血生化指標(biāo)檢測(cè)
　　分別在局部轉(zhuǎn)染病毒前及小鼠處死前采取血液標(biāo)本，測(cè)量體重、血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇水平。
　　4.血壓及心率指標(biāo)檢測(cè)

5、　　分別在局部轉(zhuǎn)染病毒前及小鼠處死前使用智能無創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)量小鼠收縮壓，舒張壓，平均動(dòng)脈壓及心率。小鼠血壓每日固定時(shí)間段測(cè)量，連續(xù)測(cè)量3天，每天測(cè)量3次，取平均值。
　　5.組織病理學(xué)染色
　　小鼠行安樂死后，將右側(cè)頸動(dòng)脈包埋后制作石蠟或者冰凍病理切片。頸動(dòng)脈切片采用HE染色觀察各組頸動(dòng)脈斑塊的大小及形態(tài);采用天狼猩紅染色觀察各組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量。頸動(dòng)脈冰凍切片采用油紅O染色觀察各組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)的含量。

6、>　　6.免疫組織化學(xué)染色
　　小鼠頸動(dòng)脈切片采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)各組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)平滑肌抗原、NPR-C、心房鈉尿肽、CNP抗原的含量。小鼠頸動(dòng)脈冰凍切片采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)各組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞抗原的含量。根據(jù)公式計(jì)算斑塊易損指數(shù):斑塊易損指數(shù)=（巨噬細(xì)胞含量百分比+脂質(zhì)含量百分比）/（平滑肌細(xì)胞含量百分比+膠原含量百分比）。
　　7.RT-PCR反應(yīng)
　　Trizol法提取小鼠右側(cè)頸動(dòng)脈組織中RN

7、A，定量后將其逆轉(zhuǎn)為eDNA，再利用熒光定量PCR法擴(kuò)增eDNA以此檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈組織中NPR-C、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、血管細(xì)胞粘附分子-1 mRNA表達(dá)水平。以小鼠β-actin作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt方法統(tǒng)計(jì)分析。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)重復(fù)3次以上。
　　8.Western blot檢測(cè)
　　提取小鼠右側(cè)頸動(dòng)脈組織中總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離各蛋白質(zhì)組分后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，隨后5％脫

8、脂牛奶封閉、TBST清洗、孵育相應(yīng)一抗過夜。次日抗原和抗體復(fù)合物孵育二抗，最后利用辣根過氧化物酶標(biāo)記的底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。使用Image J圖像分析軟件以β-actin作為內(nèi)參，定量檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈組織中NPR-C、ANP、CNP、腫瘤壞死因子-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1的蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.ApoE-/-小鼠一般情況
　　70只8周齡的雄性ApoE-/-小鼠，行右側(cè)頸總動(dòng)脈套管術(shù)并給予局部孵育慢病毒

9、或NS，共計(jì)高脂飲食11周，小鼠整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程未見感染及意外死亡。
　　2.慢病毒局部成功轉(zhuǎn)染小鼠頸動(dòng)脈
　　局部轉(zhuǎn)染病毒2周后，LV-EGFP組隨機(jī)選取的兩只小鼠，熒光顯微鏡下頸動(dòng)脈冰凍切片見斑塊處有明顯綠色熒光表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)NPR-C含量明顯增加(P＜0.05); NS組和LV-EGFP組相比較，頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)NPR-C含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0

10、.05)。Western blot顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動(dòng)脈組織中NPR-C表達(dá)量明顯增加(P＜0.05); NS組和LV-EGFP組相比較，頸動(dòng)脈組織中NPR-C表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。PCR結(jié)果顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動(dòng)脈組織中NPR-C mRNA含量明顯增加(P＜0.05); NS組和LV-EGFP組相比較，頸動(dòng)脈組織中NPR-C mRNA含量無

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)果表明慢病毒局部轉(zhuǎn)染小鼠頸動(dòng)脈成功。
　　3.NPR-C基因過表達(dá)組小鼠體重及血生化指標(biāo)
　　比較NS組、LV-EGFP組、LV-NPR-C組三組小鼠在病毒轉(zhuǎn)染前后體重及血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇水平，未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4.NPR-C基因過表達(dá)組小鼠心率及血壓水平
　　比較NS組、LV-EGFP組、LV-NPR-C組三組小

12、鼠在病毒轉(zhuǎn)染前后心率、收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓的變化，未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　5.NPR-C基因過表達(dá)組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量顯著減少
　　頸動(dòng)脈斑塊冰凍切片油紅O染色顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量明顯降低(P＜0.05); NS組和LV-EGFP組相比較，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　6.NPR-C基因過表達(dá)組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量

13、顯著減少
　　頸動(dòng)脈斑塊冰凍切片免疫組織化學(xué)染色顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組能明顯降低頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量（P＜0.05）;NS組和LV-EGFP組相比較，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　7.NPR-C基因過表達(dá)組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)平滑肌抗原含量顯著減少
　　頸動(dòng)脈斑塊切片免疫組織化學(xué)染色顯示:與NS組和LV-EGFP組兩對(duì)照組相比較，LV-NPR-C實(shí)驗(yàn)組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)平滑肌

14、抗原含量明顯降低（P＜0.05）;NS組和LV-EGFP組相比較，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　8.NPR-C基因過表達(dá)組頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)膠原含量顯著增加
　　頸動(dòng)脈斑塊切片天狼猩紅染色顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組能明顯增加頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原含量（P＜0.05）;NS組和LV-EGFP組相比較，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　9.NPR-C基因過表達(dá)組頸

15、動(dòng)脈斑塊易損指數(shù)顯著降低
　　根據(jù)斑塊易損指數(shù)公式計(jì)算，與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動(dòng)脈斑塊易損指數(shù)明顯下降(P＜0.05);NS組和LV-EGFP組相比較，兩組頸動(dòng)脈斑塊易損指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　10.NPR-C基因過表達(dá)顯著減少ANP、CNP配體表達(dá)
　　頸動(dòng)脈斑塊切片免疫組織化學(xué)染色顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組能明顯降低頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)AN

16、P配體(P＜0.05)和CNP配體(P＜0.05)的含量;NS組和LV-EGFP組相比較，頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)ANP配體(P＞0.05)和CNP配體（P＞0.05）的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　Western blot顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組能明顯降低頸動(dòng)脈組織中ANP配體(P＜0.05)和CNP配體(P＜0.05)表達(dá)量;NS組和LV-EGFP組相比較，頸動(dòng)脈組織中ANP配體(P＞0.05)和CNP配體

17、(P＞0.05)的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　11.NPR-C基因過表達(dá)顯著減少炎癥因子TNF-α、MCP-1、MMP-9、VCAM-1的表達(dá)
　　Western Blot顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組能明顯降低頸動(dòng)脈組織中TNF-α(P＜0.05)、MCP-1(P＜0.05)的蛋白含量;NS組和LV-EGFP組相比較，頸動(dòng)脈組織中TNF-α(P＞0.05)、MCP-1(P＞0.05)的蛋白含量差

18、異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　PCR結(jié)果顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動(dòng)脈組織中MMP-9 mRNA和VCAM-1 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05);NS組和LV-EGFP組相比較，頸動(dòng)脈組織中MMP-9 mRNA和VCAM-1 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　構(gòu)建小鼠頸動(dòng)脈易損粥樣斑塊模型，局部轉(zhuǎn)染過表達(dá)NPR-C的慢病毒，證實(shí)了NPR-C能夠改善斑塊的組