一種老年癡呆蛋白疫苗制備工藝的研究.pdf

1、分類號：Q78單位代碼：單位代碼：10190研究生學(xué)號：研究生學(xué)號：201405037密級：公開碩士學(xué)位論文一種老年癡呆蛋白疫苗制備工藝的研究StudyonPreparationTechnologyofProteinVaccinefAlzheimersDisease研究生姓名研究生姓名：金浩專業(yè)：化學(xué)指導(dǎo)教師及職稱：指導(dǎo)教師及職稱：殷玉和殷玉和講師講師培養(yǎng)單位：長春工業(yè)大學(xué)長春工業(yè)大學(xué)2017年6月研究生學(xué)位論文I摘要老年性癡呆已經(jīng)成為

2、全球的―流行病‖之一，是影響老年健康的第四殺手。在老年性癡呆癥中最常見的是阿爾茨海默病。阿爾茨海默病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，是發(fā)生在老年期以及老年前期的原發(fā)性腦病，其主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)持續(xù)性功能活動障礙。目前，研究者普遍認(rèn)為，大腦組織中β淀粉樣蛋白的過度沉積是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及認(rèn)知功能障礙的主要原因，因此，以刺激機體產(chǎn)生Aβ特異性抗體從而清除大腦內(nèi)Aβ142沉積為目的的Aβ主動免疫疫苗，是治療預(yù)防阿爾茨海默病的重要方法。諾如病毒P顆粒

3、，具有三個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，非常適合于外源表位的插入；此外，諾如病毒P顆粒能夠在體外自主裝形成24聚體形式，是非常好的抗原展示平臺。本研究中選擇Aβ16作為表位，諾如病毒P顆粒為載體，將3拷貝的Aβ16基因分別插入到諾如病毒P顆粒蛋白載體的3個環(huán)狀結(jié)構(gòu)域上，通過基因重組技術(shù)得到質(zhì)粒pET26bPP3copyAβ16loop123。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，分別在小試和發(fā)酵罐水平對蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化以提高蛋白產(chǎn)量。確認(rèn)最優(yōu)

4、蛋白表達(dá)誘導(dǎo)條件為：在小試中誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.5mmolL，16℃誘導(dǎo)12h；在發(fā)酵罐中最適宜發(fā)酵時間為11h。誘導(dǎo)條件優(yōu)化后，蛋白的表達(dá)量有明顯提升，其中，可溶性表達(dá)蛋白的表達(dá)量從小試的1.5mgL增加到中試的8mgL；包涵體表達(dá)蛋白的表達(dá)量由小試的60mgL增加到中試的300mgL。同時，研究采用SuperdexTM200、透射電鏡以及粒徑儀對目的蛋白的多聚體形式和顆粒大小進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，目的蛋白以24聚體，12聚體以及2聚

5、體三種多聚體形式存在，可溶性表達(dá)中24聚體所占比例較大，蛋白顆粒大小為24nm左右，而包涵體復(fù)性蛋白中12聚體所占比例較大，蛋白顆粒大小約為16nm。最后，通過小鼠免疫檢測該蛋白疫苗的免疫原性和安全性。結(jié)果顯示重組蛋白疫苗具有很好的免疫原性，能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生高濃度Aβ142特異性抗體，且不會引起T細(xì)胞免疫反應(yīng)，免疫動物不會出現(xiàn)腦膜炎癥狀，具有良好的安全性。本研究為PP3copyAβ16loop123蛋白疫苗實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的實