胎盤源性內皮祖細胞始動嬰幼兒血管瘤發(fā)生發(fā)展的研究.pdf

1、研究背景：
　　嬰幼兒血管瘤(Infantile hemangioma，IH)是嬰幼兒最常見的良性腫瘤。新生兒發(fā)病率高達10-12％，約60%的病變發(fā)生于頭頸部，嚴重者可影響患兒容貌、受累器官功能、心理健康等。若不加以干涉治療，大多數IH患者在一歲內快速增長，之后在童年時慢慢退化為纖維脂肪組織。但約10%的IH由于其生長過于迅速、面積過大或者生長部位特殊，可能導致毀容、畸形、功能障礙甚至危及生命等。但目前IH特征性增殖、消退機制尚

2、未闡明，致使其臨床治療效果也不甚滿意。
　　目前關于IH的發(fā)生機制的探討，主要集中于血管瘤內皮細胞的起源方面，其主要假說有：遺傳和基因突變學說、胎盤絨毛膜內皮細胞學說、干細胞學說等，但目前仍未有一種學說能夠很好闡明IH早期過度增生與后期自行消退的臨床特征。以往認為IH是始動于血管內皮細胞，但2008年Khan等首次報道從IH組織中提取出血管瘤干細胞后，證實IH中存在干細胞。課題組前期研究發(fā)現，剛分娩出的嬰幼兒若發(fā)現存在血管瘤，立即

3、取嬰幼兒血管瘤的胎盤組織（IHP），實驗發(fā)現組織中存在內皮祖細胞，HE染色結果顯示，增生期IH與IHP的病理學組織形態(tài)相類似，而消退期IH組織中，未見內皮祖細胞的表達。血管內皮祖細胞是干細胞的一種，能夠定向分化為血管內皮細胞，同時具有自我更新、無限增殖、多向分化的能力，與增生期血管瘤臨床表現相似。
　　綜上所述，本課題推測：嬰幼兒血管瘤的血管增生，是血管內皮祖細胞通過胎盤組織，動員、遷移、定植并異常聚居于胚胎期的胎兒某個部位，在嬰

4、兒出生后，由于胎盤產生的生長抑制因子被解除，在雌激素、各種細胞因子、特別是內環(huán)境改變等因素的作用下，選擇性激活內皮祖細胞，激活的內皮祖細胞出現增殖，其絲足沿著促血管生長因子分泌充足的地方遷移，形成血管分支，芽生的血管側枝吻合形成血管叢，導致血管瘤增生期，血管瘤內皮細胞大量增殖、血管快速新生（出生~1歲左右）；隨后在一系列信號通路的調控下，hEPCs逐漸分化為內皮細胞后其自身表達逐漸減少，IH進入相對靜止期(1歲后)，之后嬰幼兒體內微環(huán)境

5、的改變導致血管瘤內皮細胞逐漸被纖維結締組織及脂肪組織所取代，從而產生特異性的消退期（5~10歲）；我們認為這種推測血管瘤的發(fā)生、發(fā)展、消退符合IH臨床表現，解釋較為合理。
　　目前認為內皮細胞過度增殖，血管迅速生長是IH病理組織學的最大特點。新生血管的生長和發(fā)育是由一系列血管生長因子通過許多信號通路完成的。傳統(tǒng)的觀點認為血管形成只存在于成體，而血管生成僅限于胚胎。隨著hEPCs在成體的分離成功，證明血管生成也發(fā)生于成體。因此，血管

6、形成、血管生成可能是人類血管新生的基本過程。hEPCs是內皮細胞的前體細胞，在形態(tài)學無法將hEPCs與其他細胞區(qū)分開來，所以主要靠分子標志識別。目前共識，CD34、CD133共同標記的即為hEPCs。
　　那么，各種細胞因子、內環(huán)境信號改變是如何來調控血管瘤的發(fā)生與發(fā)展的呢？目前，在其他腫瘤的研究中也發(fā)現，血管內皮細胞及間質細胞分泌的促血管生成因子和抑血管生成因子，共同調控血管的發(fā)生與血管的形成。血管的新生是由于血管內皮細胞在血管

7、內皮生長因子(VEGF)等許多細胞因子的誘導下，發(fā)生遷移和增殖，導致血管大量增生。 VEGF是目前發(fā)現的最強的促血管生成因子，是新生血管形成過程中的中心調控因子及血管內皮細胞特異性的有絲分裂原，多種腫瘤動物模型研究已證實阻斷 VEGF信號通路能夠降低腫瘤微血管密度，從而抑制腫瘤的生長。
　　有研究顯示DLL4/Notch信號通路過度表達，可產生非功能性血管，管腔纖細，血流明顯減少，導致腫瘤缺血、缺氧，從而抑制腫瘤增生。VEGF可誘

8、導DLL4表達，激活DLL4/Notch信號通路，提示VEGF對DLL4/Notch信號通路有正調節(jié)作用。而此信號通路的活化可減弱內皮細胞對VEGF誘導的血管新生反應，提示其可能會反饋抑制VEGF信號通路的功能活性。因此，只有在VEGF和DLL4/Notch信號通路的協(xié)調作用下，血管瘤血管新生才能有序進行。
　　目的
　　為進一步研究證實上述猜想，本研究擬
　　1、在IH不同時期及IHP中，檢測CD34/CD133染標

9、記的hEPCs的表達水平，證實增生期及IHP組織中hEPCs呈顯著性高表達，而消退期低表達或不表達，從而證實hEPCs與IH的發(fā)生發(fā)展密切相關，驗證我們的推測，胎盤源性hEPCs始動IH的發(fā)生發(fā)展。
　　2、在IH不同時期，免疫組織化學法檢測CD34、CD133、VEGF、DLL4的表達水平，探討VEGF-DLL4/Notch信號通路參與調控嬰幼兒血管瘤的血管新生。
　　方法：
　　1、收集廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院病理

10、科2014-2017年嬰幼兒血管瘤存檔蠟塊50例其中男22例，女28例，年齡1月～2歲、平均1.2歲，患者術前均未做任何輔助性治療。將所有標本進行常規(guī)HE染色，免疫組織化學SP法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)，按Mulliken分類標準并結合PCNA的表達進行分組：石蠟標本中增生期血管瘤26例，消退期血管瘤24例。應用免疫組織化學SP法檢測IH增生期、消退期組織中第Ⅷ因子相關抗原(FⅧRAg)、VEGF、DLL4及CD34的表達水平。采

11、用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)對VEGF和DLL4的表達進行定量分析，并測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積。為下一步實驗提供依據。
　　2、收集廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院婦產科2014-2017年出生后發(fā)現疑似血管瘤的新生兒，在產婦胎盤娩出30分鐘內，在無菌操作下，切取胎盤葉狀絨毛膜部分。取材15例，常規(guī)HE染色后，鑒定符合嬰幼兒IHP者5例，例其中男3例，女2例，經家屬同意后取

12、正常胎盤組織5例，作為陰性對照組。用免疫組化及免疫熒光法鑒定IHP及增生期IH組織中存在hEPCs，同時檢測CD34、CD133、DLL4的表達水平。
　　結果：
　　1、通過免疫組化實驗結果顯示：嬰幼兒血管瘤增生期組VEGF、DLL4、CD34的表達明顯高于消退期組和正常皮膚組(P＜0.05)，而后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。VEGF表達陽性血管瘤的MVD為37.6±1.6，VEGF表達陰性血管瘤的MVD為1

13、6.4±2.0，兩者差異具有顯著性差異（t=4.87，P＜0.01）。VEGF和DLL4陽性面積率的相關性分析顯示, VEGF和DLL4在增生期及消退期IH組織中的表達均呈正相關，r=0.821，P=0.003；DLL4：r=0.830，P=0.003。
　　在IHP組織中，CD34，CD133以及DLL4主要定位于葉狀絨毛膜內側，陽性結果呈現彌漫分布的棕黃色顆粒，CD34，CD133及DLL4表達顯著。CD34，CD133及DL

14、L4陽性率與陰性率相比，差異具有顯著性意義（P均＜0.01）。免疫熒光法鑒定時，CD34熒光染色時呈綠光，CD133呈紅光，雙染色顯著時呈黃色或黃綠色熒光，核染DAPI呈藍色，進一步證實上述實驗結果。
　　結論：
　　1.CD34、CD133、DLL4及CD34、CD133共同染色標記的內皮祖細胞在嬰幼兒血管瘤增生期及IHP組織中高表達，消退期及正常胎盤組織中低表達或不表達，提示內皮祖細胞在嬰幼兒的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色