黃芩苷調節(jié)DC亞群分化與功能治療URSA作用與機制研究.pdf

1、背景：自然流產連續(xù)發(fā)生2次或2次以上，為復發(fā)性自然流產（recurrent spontaneous abortion，RSA），RSA的發(fā)病率為育齡婦女的1％至5%。RSA病因非常復雜，除少數染色體、內分泌、解剖、感染等因素外，約80%病因不明，稱為不明原因型復發(fā)性自然流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。URSA危害育齡婦女生殖健康，隨著生殖免疫學研究的不斷深入，母胎免

2、疫耐受機制在URSA發(fā)病中的作用日益受到關注。
　　正常妊娠類似成功的同種異體移植，其建立與維持有賴于母胎免疫耐受的形成，免疫細胞在其中發(fā)揮著重要作用。研究證實，URSA患者及模型動物存在T淋巴細胞亞群失衡現象；我們前期研究亦證實妊娠結局與T細胞亞群偏移狀態(tài)密切相關，但導致流產發(fā)生時T細胞亞群失衡現象的始動因素尚不清楚，成為發(fā)掘逆轉T細胞亞群失衡方法與藥物的瓶頸。樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是體內功能最強大的

3、抗原提呈細胞（antigen presenting cell, APC），也是唯一能夠活化初始T淋巴細胞的抗原提呈細胞（antigen presenting cell, APC），處于啟動與調控T細胞適應性免疫應答的關鍵環(huán)節(jié)。最新研究顯示，除引發(fā)免疫應答抗微生物感染之外，DC在誘導免疫耐受，維持機體內環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。目前，尚未見DC亞群與功能影響在URSA中作用的系統(tǒng)報道，更缺乏藥物靶向調節(jié)DC亞群分化與功能治療URSA的研究

4、，此方向的深入探討有望成為防治URSA的突破口。
　　目前URSA西醫(yī)治療主要采用補充妊娠激素的方法，但存在療效不穩(wěn)定、副作用大等缺點。中醫(yī)藥治療習慣性流產歷史悠久，具有療效好、副作用少的優(yōu)點。黃芩是中醫(yī)安胎常用藥物，《丹溪心法》稱為“安胎之圣藥”，但其安胎作用的機制及療效物質基礎尚未明確。黃芩苷是黃芩的主要有效成份，課題組前期發(fā)現URSA小鼠母胎界面DC表面共刺激分子CD80及MHCⅡ類分子表達異常，黃芩苷對URSA模型小鼠DC

5、表面共刺激分子CD80及MHCⅡ類分子mRNA表達具有調節(jié)作用，推測DC亞群與功能變化在URSA發(fā)病中扮演著重要角色，可能是黃芩苷藥物干預的關鍵靶點。
　　目的：通過臨床及動物實驗，從細胞、分子、基因水平，探討DC亞群及功能變化在URSA患者及模型動物中的作用，闡釋黃芩苷調節(jié)DC亞群及功能治療URSA的作用與關鍵機制，進一步闡釋URSA的免疫學發(fā)病機制，為臨床治療提供新的靶點與途徑，為創(chuàng)新藥物研發(fā)提供實驗室依據。
　　方法：

6、臨床研究：①臨床標本收集與保存：抽取正常妊娠、URSA患者外周靜脈血6 mL，EDTA-2Na抗凝，分離血清及單個核細胞；②ELISA檢測各組血清IL-6、IL-12、IL-23、IL-10、TGF-β蛋白水平；③流式細胞術檢測DC亞群（pDC/cDC）及功能（表面HLA-DR分子、共刺激分子CD80/CD86、功能性分子CD274/CD275/CD205/33D1/Tim3）表達變化；④RT-PCR法檢測DC表面HLA-DR分子、共刺

7、激分子（CD80/CD86）及功能性分子（CD274/CD275/CD205/33D1/Tim3）mRNA轉錄水平。動物實驗：①URSA模型建立及藥物處理：CBA/J♀作為正常未孕組，CBA/J♀×DBA/2♂建立URSA小鼠模型及CBA/J♀×Balb/c♂作為正常妊娠小鼠模型；URSA模型小鼠給予不同劑量黃芩苷及對照溶劑干預治療；②流式細胞術檢測小鼠脾臟、母胎界面中DC亞群及表面MHC-II分子、共刺激分子（CD80/CD86）及功

8、能性分子（CD274/CD275/CD205/33D1/Tim3）表達變化；③qRT-PCR檢測DC表面MHC-II、共刺激分子（CD80/CD86）、功能性分子（CD274/CD275/CD205/33D1/Tim3）及JAK/STAT信號通路關鍵分子（STAT5/E2-2/ID2）mRNA表達變化；④Person相關性分析法分析胚胎丟失率與DC亞群與功能相關性。
　　結果：①URSA患者外周血中DC亞群與功能變化：與正常妊娠組

9、相比，URSA患者外周血中pDC（CD11c-CD123+）比例明顯降低(P<0.05)，cDC（CD11c+HLA-DR+）比例明顯升高(P<0.05)，pDC/cDC比值降低； CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD275+、CD11c+CD205+、CD11c+Tim3+的細胞比例明顯升高(P<0.05)， CD11c+CD274+、CD11c+33D1+的細胞比例明顯降低(P<0.05)；DC表面HLA

10、-DR、共刺激分子CD80、CD86、CD275、CD205、Tim3 mRNA表達水平升高(P<0.05)，33D1、CD274 mRNA表達水平降低(P<0.05)；血清中IL-6、IL-12、IL-23的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，IL-10、TGF-β的表達水平顯著降低(P<0.05)；提示DC亞群及功能變化可能在URSA發(fā)病中扮演了重要角色。②URSA小鼠脾臟、母胎界面DC亞群與功能變化：與正常妊娠組比，URSA組脾

11、臟及母胎界面的pDC（CD11c+B220+）比例降低(P<0.05)， cDC(CD11c+B220-)比例升高(P<0.05)，pDC/cDC比率降低(P<0.05);正常未孕組、正常妊娠組、URSA小鼠脾臟及母胎界面CD11c+MHC-II+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD205+、CD11c+CD275+、CD11c+Tim3+細胞比例依次升高，且URSA組明顯高于正常妊娠組(P<0.05)，而

12、CD11c+33D1+、CD11c+CD274+比例顯著降低(P<0.05);與正常妊娠組比，URSA組小鼠脾臟及母胎界面DC表面MHC-II分子、共刺激分子（CD80/CD86）及功能性分子（CD275/CD205/Tim3）mRNA轉錄水平升高(P<0.05)， CD274、33D1 mRNA轉錄水平降低(P<0.05)；提示DC亞群與功能變化參與了URSA發(fā)生，且外周淋巴器官與局部母胎界面呈相同變化趨勢。③胚胎吸收率與DC亞群分化

13、狀態(tài)及功能呈顯著相關性：胚胎吸收率與pDC亞群比例呈顯著負相關，與cDC亞群比例呈顯著正相關，與pDC/cDC比值呈顯著負相關；胚胎吸收率與脾臟及母胎界面的CD11c+MHC-II+DCs、CD11c+CD80+DCs、CD11c+CD86+DCs、CD11c+CD275+DCs、CD11c+CD205+DCs、CD11c+Tim3+DCs比例均呈顯著正相關,而與CD11c+33D1+DCs、CD11c+CD274+DCs比例呈顯著負相

14、關，提示靶向調節(jié)DC亞群與功能的方法可能成為URSA治療的有效途徑。④黃芩苷對妊娠的保護作用:與URSA對照組比，黃芩苷干預治療后，URSA小鼠的胚胎吸收率明顯降低(P<0.05)，且成劑量依賴性，提示黃芩苷對妊娠具有保護作用。⑤黃芩苷對URSA小鼠DC亞群與功能調節(jié)作用：黃芩苷干預后， URSA小鼠脾臟及母胎界面pDC亞群比例、pDC/cDC比率升高，cDC亞群比例降低， CD11c+MHC-II+、CD11c+CD80+、CD11c

15、+CD86+、CD11c+Tim3+、CD11c+CD205+、CD11c+CD275+細胞比例降低，CD11c+33D1+、CD11c+CD274+細胞比例升高，呈現劑量依賴性，提示黃芩苷能夠調節(jié)母胎界面及脾臟的DC亞群與功能變化，誘導母胎免疫耐受，治療URSA。⑥黃芩苷對JAK/STAT信號通路的調節(jié)作用：與正常妊娠組比，URSA組脾臟及母胎界面的E2-2 mRNA表達降低(P<0.05)，STAT5、ID2 mRNA表達升高(P<

16、0.05)；黃芩苷干預后，URSA小鼠脾臟及母胎界面E2-2 mRNA表達升高，STAT5、ID2 mRNA表達降低，呈現劑量依賴性，提示JAK/STAT信號通路可能是黃芩苷干預DC分化與功能、治療URSA的關鍵機制之一。
　　結論：①URSA患者及模型動物存在DC亞群及功能改變。pDC比例、cDC比例升高、pDC/cDC比率降低。DC表面MHC-II分子、共刺激分子（CD80/CD86）及功能性分子（CD275/CD205/Ti

17、m3）表達升高，CD274、33D1表達降低；細胞因子IL-6、IL-12、IL-23分泌增多，IL-10、TGF-β分泌減少。②黃芩苷能有效降低URSA小鼠胚胎吸收率，對妊娠具有保護作用。③黃芩苷能夠逆轉URSA小鼠脾臟及母胎界面DC亞群（pDC/cDC）偏移狀態(tài)，降低DC表面MHC-II分子、共刺激分子（CD80/CD86）及功能性分子（CD275/CD205/Tim3）表達，升高CD274、33D1表達，從而誘導母胎免疫耐受，治療