GasderminA3在小鼠毛囊生長(zhǎng)期向退化期轉(zhuǎn)換過(guò)程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、毛囊是皮膚的基本結(jié)構(gòu)單位之一，也是表皮的附屬物。在哺乳動(dòng)物中，毛發(fā)要不斷經(jīng)歷毛發(fā)脫落和再生的循環(huán)，周而復(fù)始，從個(gè)體出生一直持續(xù)至死亡。毛囊的周期包括三個(gè)階段:生長(zhǎng)期(Anagen)、退化期(Catagen)以及靜止期(Telogen)。GSDMDC家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)全新的含有Gasdermin結(jié)構(gòu)域的蛋白超家族，包括DFNA5、DFNA5L、GSDM、GSDML和MLZE五個(gè)成員。其中GSDM家族包括三個(gè)成員，GSDMa1，GSDM

2、a2，GSDMa3，其最初被認(rèn)為是小鼠皮膚幾種突變的成因基因，這提示GSDM家族及其相關(guān)基因已經(jīng)有進(jìn)化為在上皮表達(dá)的趨勢(shì)。先前的研究表明，小鼠的GSDMa3基因?qū)γl(fā)的生長(zhǎng)有著重要的作用，其突變導(dǎo)致毛發(fā)生長(zhǎng)的異常；一系列的毛發(fā)異常與其突變有關(guān)，如Runkel等通過(guò)定位克隆策略鑒定2型毛發(fā)異常（Rco2)，數(shù)據(jù)顯示GSDMa3是一個(gè)突變熱點(diǎn)區(qū)域，GSDMa3突變可以引起Rim3、Rco2、Reden、Bsk、Dfl、Fgn型小鼠的毛發(fā)異常

3、。那么，GSDMa3基因突變后會(huì)引起毛囊結(jié)構(gòu)的哪些變化？到底是通過(guò)何種方式引起毛發(fā)的異常呢？外源干擾會(huì)引起此基因的變化嗎？
　　 本課題采用免疫組織化學(xué)（IHC）、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和western技術(shù)，初步探索GSDMa3基因突變前后檢測(cè)毛囊Wnt 信號(hào)方面各因子以及凋亡方面等因子的變化情況，探索GSDMa3基因是否參與Wnt信號(hào)通路以及凋亡通路，進(jìn)而調(diào)控毛囊的生長(zhǎng)；利用TUNEL等方法檢測(cè)GSDMa3基因

4、突變前后，毛囊細(xì)胞中DNA的斷裂情況，推測(cè)GSDMa3基因突變后，改變毛囊的凋亡；分別利用皮下注射誘導(dǎo)凋亡的試劑TNF-a誘導(dǎo)毛囊凋亡，進(jìn)而通過(guò)一系列的手段和方法檢測(cè)凋亡因子以及GSDMa3基因的表達(dá)情況；并在正常的C57BL/6(B6)小鼠和GSDMa3基因突變小鼠皮下注射帶有GSDMa3基因的表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)一系列方法檢測(cè)毛囊的形態(tài)變化以及凋亡分子變化情況，證明GSDMa3基因參與毛囊的凋亡通路，改變毛囊的凋亡。主要結(jié)果如下：

5、　　 ①檢測(cè)了GSDMa3基因突變前后，毛囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。在小鼠出生后8d，GSDMa3基因突變鼠的毛囊明顯變長(zhǎng)，經(jīng)度比B6小鼠毛囊明顯更垂直，表皮和真皮都已經(jīng)加厚；在小鼠出生后11d，毛囊處于生長(zhǎng)期的中后期，GSDMa3基因突變鼠的毛囊進(jìn)一步生長(zhǎng)，經(jīng)度也明顯垂直于B6小鼠毛囊，表皮真皮進(jìn)一步增厚；在小鼠出生后16d、18d，B6小鼠的毛囊處于退化期，毛干變短，毛球萎縮，真皮表皮變薄，而GSDMa3基因突變鼠的毛囊的毛球出現(xiàn)部分的萎

6、縮，毛干并未縮短，毛囊的經(jīng)度更垂直于B6小鼠毛囊，真皮表皮也未變??；在小鼠出生后的24d，B6小鼠的毛囊處于靜止期，毛囊基本縮到整個(gè)毛囊周期中最短，只剩下毛乳頭和部分毛干，而GSDMa3基因突變鼠基本維持在退化期的形態(tài)，形態(tài)上沒(méi)有比較明顯的變化，未按照正常情況進(jìn)入毛囊的靜止期狀態(tài)。
　　 ②利用IHC、RT-PCR、western技術(shù)檢測(cè)GSDMa3基因突變前后，檢測(cè)Wnt信號(hào)的關(guān)鍵成員β-catenin和Wnt5a，發(fā)現(xiàn)β-c

7、atenin在毛囊的各個(gè)部位表達(dá)明顯升高，Wnt 5a表達(dá)明顯降低。
　　 ③利用IHC、RT-PCR、western技術(shù)檢測(cè)GSDMa3基因突變后，檢測(cè)凋亡信號(hào)途徑的執(zhí)行分子Caspase-3表達(dá)明顯降低，利用TUNEL技術(shù)檢測(cè)GSDMa3基因突變后，DNA在毛囊的內(nèi)外根鞘斷裂要比突變前明顯降低；
　　 ④利用外源性注射TNF-a后，B6小鼠GSDMa3基因和Caspase-3基因的表達(dá)明顯升高，凋亡的各因子也明顯增高

8、，凋亡的跡象也更為明顯。而GSDMa3基因突變鼠的GSDMa3基因和Caspase-3基因只是有所增加，但是不如B6鼠那樣明顯。
　　 ⑤利用外源性過(guò)表達(dá)GSDMa3基因表達(dá)質(zhì)粒，不管是B6小鼠還是GSDMa3基因突變小鼠，伴隨著GSDMa3基因增加的同時(shí)，凋亡的各因子也明顯增加，凋亡的跡象也更明顯。
　　 綜上所述，本課題表明，GSDMa3基因突變后，可能通過(guò)改變Wnt 信號(hào)通路以及凋亡信號(hào)通路改變毛囊的周期及其生長(zhǎng)情