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文檔簡介
1、皮膚創(chuàng)傷后的修復(fù)反應(yīng)首先是血液凝固、血小板激活,然后,炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞等趨化、增殖,最后是肉芽組織經(jīng)改建成熟形成纖維結(jié)締組織。在此期間,機體通過凋亡機制清除“多余”細(xì)胞,調(diào)控?fù)p傷區(qū)域的細(xì)胞動態(tài)平衡,保證受損組織的修復(fù)。我們的前期研究結(jié)果表明,在皮膚損傷愈合過程中,caspase—3,—6,—7可能在誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中發(fā)揮重要作用。 Calpain是鈣激活中性蛋白酶(calc
2、ium—activated neutral protease),涉及到細(xì)胞骨架的重塑、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡。Calpain1和calpain2廣泛分布于絕大多數(shù)哺乳動物組織中。Calpain是由分子量為80KD的催化亞單位和分子量為30KD的調(diào)解亞單位組成的異二聚體。Calpain與Ca2+結(jié)合后自溶激活。目前尚未見有報道研究皮膚創(chuàng)傷后calpain1和calpain2的表達(dá)及活性變化,也未見研究calpain抑制劑對皮膚損傷愈
3、合影響的報道。故本實驗采用H.E染色、免疫組織化學(xué)染色、Western blot檢測、比色法等技術(shù)方法檢測小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain1、calpain2和其內(nèi)源性抑制劑calpastatin的表達(dá)和激活情況,同時應(yīng)用calpain抑制劑MDL28170,觀察calpain和caspase—3的活性變化,研究calpain是否在皮膚損傷愈合過程中被激活以及calpain—calpastatin系統(tǒng)變化情況,為calpain在皮膚
4、凋亡中的作用和與caspase—3關(guān)系研究提供幫助。 實驗材料和方法: 健康成年清潔級昆明系小鼠124只,雌雄不限,鼠齡8周,體重28—32克,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。其中有9只小鼠因傷后感染未被分組計數(shù),其余115只小鼠隨機分為23個組,每組5只。9個損傷組按傷后0h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d和14d分組及其一個正常皮膚對照組。6個抑制劑組給予calpain抑制劑,按傷后6h、12h、1d、
5、3d、5d和7d分組。7個對照組包括6個抑制劑對照組和1個假手術(shù)組,給予DMSO生理鹽水稀釋液。 給予乙醚吸入麻醉后,在小鼠背部中央作一1.5cm長縱行皮膚全層切口。在規(guī)定實驗時間內(nèi)將小鼠頸椎脫位處死。用100%DMSO將MDL28170溶解,再用生理鹽水配制成濃度為1mg/ml的MDL28170注射液(DMSO終濃度為2%)。抑制劑組切創(chuàng)后即首次腹腔內(nèi)注射,劑量為24mg/kg,以后每12小時重復(fù)給藥一次,并在處死前2h再給藥
6、一次,每次劑量為12mg/kg。對照組小鼠按體重給予與抑制劑組相同劑量的含2%DMSO的生理鹽水。在皮膚創(chuàng)口處剪取1.5cm×1.0cm皮膚組織處理后進行H.E.染色、免疫組織化學(xué)染色、Western blot檢測和calpain、caspase—3的酶活性測定。實驗數(shù)據(jù)用x±s表示,在SPSS for Windows12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)方差分析。 實驗結(jié)果: 第一部分:皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain及calpast
7、atin表達(dá)的研究 1、皮膚切創(chuàng)愈合的病理形態(tài)學(xué)變化 傷后6h,可見多型核細(xì)胞(根據(jù)細(xì)胞核形態(tài)命名,主要為中性粒細(xì)胞)浸潤增多;傷后12h,皮下組織內(nèi)有大量滲出和浸潤的多型核細(xì)胞及少量單個核細(xì)胞;傷后1d,創(chuàng)緣周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤,以單個核細(xì)胞為主;傷后3d,肉芽組織增多,成纖維細(xì)胞開始增生;傷后5d,炎細(xì)胞減少,大量新生毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞及纖維細(xì)胞出現(xiàn):傷后7d,肉芽組織大量形成,成纖維細(xì)胞增生達(dá)高峰;傷后10~
8、14d,肉芽組織開始纖維化。 2、皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain1、calpain2和calpastatin免疫組織化學(xué)研究 calpain1、calpain2和calpastatin陽性表達(dá)主要分布于多型核細(xì)胞、單個核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(細(xì)胞種類主要根據(jù)形態(tài)來區(qū)分)。三者的陽性細(xì)胞比率存在時間規(guī)律性。 3、皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain1、calpain2和calpastatin蛋白表達(dá)的研究 c
9、alpain1、calpain2和calpastatin的表達(dá)存在時間規(guī)律性變化,calpain1和calpain2前體蛋白表達(dá)在傷后5d達(dá)高峰,其裂解片段的表達(dá)分別在傷后3d和5d明顯增多,calpastatin降解片段在傷后3d表達(dá)最大。 4、calpain和caspase—3酶活性檢測 傷后1d,calpain相對活性值大幅度升高(187.377±7.136%),經(jīng)過明顯下降之后,傷后5d,再次升高達(dá)最大值(208
10、.253±6,098%)。傷后12h至5d,caspase—3活性倍數(shù)增值持續(xù)升高至最大值(41.095±2.022),經(jīng)過明顯下降之后,傷后10d,再次升高(39,635±1.575)。 第二部分:calpain抑制劑MDL28170對小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程的影響觀察 1、calpain抑制劑MDL28170對病理形態(tài)學(xué)變化的影響 抑制劑組皮膚創(chuàng)口愈合過程較對照組快。傷后7d,組織學(xué)觀察到抑制劑組小鼠皮膚切創(chuàng)區(qū)較
11、對照組新增長上皮層次多,活躍,表皮完全愈合。 2、calpain抑制劑MDL28170對calpain1、calpain2和calpastatin表達(dá)影響的免疫組織化學(xué)研究 抑制劑組傷后1d,calpain1陽性細(xì)胞率明顯增加至高峰,達(dá)(61.526±6.422%),傷后3d,明顯下降,在傷后5d至7d,陽性細(xì)胞率明顯增加。各抑制劑組陽性細(xì)胞率與相應(yīng)對照組相比較均存在顯著性差異。 抑制劑組傷后6h至12h,cal
12、pain2陽性細(xì)胞數(shù)呈小幅度增加,在傷后1d,下降至最低(43.760±5.295%),以后,陽性細(xì)胞率逐漸增加,至傷后7d,陽性細(xì)胞率達(dá)高峰(53.940±4.589%)。各抑制劑組陽性細(xì)胞率與相應(yīng)對照組相比較均存在顯著性差異。 抑制劑組calpastatin陽性細(xì)胞率在傷后6h最低(36.962±4.541%),在傷后1d至7d,陽性細(xì)胞率逐漸增加,至傷后7d達(dá)高峰(87.799±4,941%)。從傷后12h至7d,抑制劑組
13、的calpastatin陽性細(xì)胞率與相應(yīng)對照組相比較均存在顯著性差異。 從傷后6h至7d,抑制劑組的calpain1和calpain2陽性細(xì)胞率明顯低于對照組。從傷后12h至7d,抑制劑組的calpastatin陽性細(xì)胞率明顯高于對照組。 3、calpain抑制劑MDL28170對calpain1、calpain2和calpastatin表達(dá)影響的蛋白表達(dá)研究 抑制劑組calpain1和calpain2前體蛋白雜
14、交條帶染色強度以傷后6h時為最低,隨損傷時間的延長而逐漸增強,在傷后7d達(dá)最大。傷后6h至7d,檢出染色強度較弱的calpain1和calpain2裂解片段蛋白雜交條帶。 抑制劑組calpastatin82kDa裂解片段蛋白雜交條帶染色強度在傷后6h最低,以后逐漸增加,在傷后7d達(dá)最大。從傷后6h開始,calpastatin50kDa裂解片段蛋白雜交條帶染色強度逐漸增加,至傷后3d達(dá)最大,以后蛋白雜交條帶染色強度逐漸下降。
15、 除7d外,抑制劑組calpain1前體表達(dá)明顯低于對照組,抑制劑組calpain1和calpain2活性片段表達(dá)明顯低于對照組。Calpastatin裂解片段雜交條帶染色強度明顯高于對照組。 4、calpain抑制劑MDL28170對calpain和caspase—3酶活性影響的研究 在傷后6h至ld抑制劑組calpain相對活性值開始逐漸增加,傷后3d有所下降,在傷后5d,其相對活性值達(dá)最大(151.667±5.4
16、87%),在傷后7d達(dá)最低值(131.730±7.087%)。 抑制劑組caspase—3活性倍數(shù)增值在傷后6h最低(5.952±1.407),以后逐漸增加,至5d達(dá)高峰(30.270±1.830)。 傷后12h至7d,抑制劑組calpain相對活性值和caspase—3活性倍數(shù)增值均明顯低于對照組。 結(jié)論: 1、正常小鼠皮膚中calpain1、calpain2和calpastatin在表皮層、汗腺、毛囊
17、和皮肌層定位表達(dá)。 2、小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain1和calpain2均被激活。 3、小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain在caspase—3上游參與細(xì)胞凋亡。 4、抑制calpain活性可加速了小鼠皮膚切創(chuàng)愈合進程。 5、calpain參與單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增生,并有可能與單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。 6、calpain1有望成為皮膚損傷時間推斷上具有實際應(yīng)用價值的參考指標(biāo)。
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