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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:淚腺功能異常是干眼的主要原因,而自身免疫淚腺炎如Sjogren’s綜合癥是淚液分泌不足的常見原因。本研究的目的是探討兔淚腺上皮細(xì)胞激活自體外周血淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)兔自身免疫干眼模型,并對(duì)臨床體征和組織病理變化進(jìn)行評(píng)估;采用四環(huán)素基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)(Tet系統(tǒng))調(diào)控的AAV載體介導(dǎo)IL-10轉(zhuǎn)基因治療,觀察IL-10在淚腺和眼表的表達(dá)時(shí)間及變化,評(píng)估IL-10對(duì)淚腺免疫病理和眼表體征的作用。
方法:
1.結(jié)合濾
2、膜分離和密度梯度離心法分離提純兔淚腺上皮細(xì)胞(pLGEC),對(duì)分離細(xì)胞的活性、純度、形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。分離的pLGEC體外培養(yǎng)2d后gamma射線照射,與等量(105細(xì)胞/孔,96孔板)自體外周血淋巴細(xì)胞(PBL)混合培養(yǎng)5d。[3H]-thymidine摻入法鑒定PBL增殖率。對(duì)培養(yǎng)前及培養(yǎng)后PBL行細(xì)胞表面抗T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4和CD8單克隆抗體染色和FACS分析。
2.新西蘭白兔左眼下淚腺切除,分離淚腺上皮細(xì)胞體外
3、培養(yǎng)2d,gamma線照射,與體外獨(dú)立培養(yǎng)2d的自體PBL混合培養(yǎng)5d,[3H]-thymidine摻入法測(cè)定PBL激活情況。自平行培養(yǎng)的混合細(xì)胞內(nèi)分離激活的PBL,用于自體過繼轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型制備。[3H]-thymidine摻入實(shí)驗(yàn)測(cè)定激活指數(shù)大于2者將分離的PBL經(jīng)耳靜脈注射回供體兔誘發(fā)自身免疫干眼病(ID/IV)。致病組一組注射后4周處死(ID/IV4,n=9),另一組注射后8周處死(ID/IV8,n=6)。陰性對(duì)照組(n=8)摘除
4、左眼下淚腺,耳靜脈注射未經(jīng)混合培養(yǎng)的自體外周血淋巴細(xì)胞(未激活)。未經(jīng)任何處理的正常兔作為正常對(duì)照組(n=4)。注射前及注射后每2周雙眼眼表臨床檢查,包括Schirmer I實(shí)驗(yàn)、BUT和rose Bengal染色。處死后收集兔上、下淚腺,結(jié)膜和唾液腺進(jìn)行組織病理H&E染色和免疫組化染色。
3.與淚腺上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)激活的自體外周血淋巴細(xì)胞注射回供體兔誘發(fā)自身免疫性淚腺炎(n=16)。注射后4周,一組下淚腺注射AAV2-t
5、etON-vIL-10(1x108 pfu/200 L)轉(zhuǎn)基因治療(ID/Rx,n=8);未注射組作為對(duì)照組(ID,n=8),兩組兔每日飲用水內(nèi)均加入強(qiáng)力霉素(200 mg/kg),誘導(dǎo)vIL-10表達(dá)。致病后16周(轉(zhuǎn)基因治療后12周)處死兔取淚腺進(jìn)行病理和免疫組化分析。
結(jié)果:
1.光學(xué)顯微鏡鏡檢顯示分離的細(xì)胞主要為直徑為16 um的單個(gè)腺泡細(xì)胞或3-20個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),培養(yǎng)4天時(shí)細(xì)胞聚集成腺泡樣細(xì)胞
6、團(tuán)。PBL-pLGEC混合細(xì)胞培養(yǎng)組[3H]-thymidine摻入增殖指數(shù)是單獨(dú)PBL組或照射后pLGEC組的5-8倍;FACS分析顯示與未激活的單獨(dú)培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞群相比,被自體淚腺上皮細(xì)胞激活后的外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞數(shù)含量增加了約2倍。在激活前外周血CD4+T細(xì)胞占T細(xì)胞的20%,而激活后增高到70%。CD8+T細(xì)胞在激活反應(yīng)前及激活反應(yīng)后含量無明顯改變。B細(xì)胞的含量在激活前后也保持不變或減少。
2.與正常組相
7、比,靜脈注射致病后4周淚液分泌減少50%,淚膜破裂時(shí)間縮短70%。Rose Bengal染色顯示眼表上皮缺損,但與直接淚腺注射致病組比較程度減輕。靜脈注射后4周淚腺內(nèi)腺管周圍和小血管周圍頻繁可見以CD+T細(xì)胞為主的大的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶;同時(shí)可見淋巴流動(dòng)樣浸潤(rùn)區(qū)。注射后8周淚腺病理改變較4周加重,顎下腺腺葉內(nèi)也可見大面積的腺泡變性區(qū)和淋巴流動(dòng)樣浸潤(rùn)灶。
3.ID/Rx組臨床體征較ID組總體明顯改善。組織病理檢查顯示ID組可見散
8、在大的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶和腺泡變性或萎縮,而ID/Rx組淋巴浸潤(rùn)灶減少、變小。與ID組相比,ID/Rx組淚腺內(nèi)CD18+細(xì)胞增加5倍之多,CD4:CD8比率減少16倍,而RTLA+細(xì)胞數(shù)兩組間無差異。
結(jié)論:
1.結(jié)合濾膜分離和密度梯度離心法可獲得較高純度的淚腺上皮細(xì)胞,培養(yǎng)、照射后可成功激活自體外周血淋巴細(xì)胞。
2.被淚腺抗原激活的淋巴細(xì)胞經(jīng)耳靜脈注射回供體兔可歸巢到淚腺和顎下腺并促發(fā)自身免疫過程
9、,說明這些部位本質(zhì)上包含抗原提呈細(xì)胞,這些細(xì)胞表達(dá)致病性自身抗原表位;同時(shí)還含有招募CD4+T細(xì)胞的化學(xué)因子和淋巴細(xì)胞歸巢分子。這種經(jīng)耳靜脈途徑制備的兔干眼模型,由于顎下腺和淚腺同時(shí)受累,更逼真的模擬了Sjogren’s綜合征。該模型更適用于闡明Sjogren’s發(fā)病機(jī)理和病理生理的研究,同時(shí)也是評(píng)估治療方法的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀?br> 3.AAV介導(dǎo)的vIL-10轉(zhuǎn)基因治療可改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫淚腺炎的臨床體征和病理變化。通過免疫組織
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