結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變的臨床與基礎(chǔ)研究.pdf

1、背景：結(jié)締組織病(connective tissue disorders,CTDs)是一類通過自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體損傷的疾病,這類疾病幾乎可以累及全身各個(gè)器官。肺臟含有豐富的膠原纖維和血管,并具有免疫調(diào)節(jié)、代謝、內(nèi)分泌等功能,是各種結(jié)締組織病較易侵犯的臟器。結(jié)締組織病引起的肺損害表現(xiàn)多樣,其中較為常見的是肺間質(zhì)病變,被稱為結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變(interstitial lung disease with connectivetiss

2、ue disorders.CTD-ILD)。其病理改變?cè)缙谥饕菨B出性病變?yōu)橹鞯姆闻菅?隨著病情進(jìn)展,膠原廣泛沉積,最終導(dǎo)致不可逆性肺間質(zhì)纖維化及肺功能損害。
　　 結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變的病理類型復(fù)雜,所有肺間質(zhì)病變的病理類型都可存在于CTD-ILD中,而且可同時(shí)并存于同一患者,CTD-ILD的病理類型目前公認(rèn)的是采用2002年由ATS和ERS推薦的肺間質(zhì)病變的分類標(biāo)準(zhǔn)。
　　 CTD-ILD的發(fā)病率高、死亡率高,缺

3、乏統(tǒng)一規(guī)范的治療手段,最常使用的激素和環(huán)磷酰胺等治療方法易繼發(fā)感染,使該并發(fā)癥成為目前臨床研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)著重對(duì)結(jié)締組織病所致肺間質(zhì)病變的病理進(jìn)行分析,探索病理類型與原發(fā)病、影像學(xué)、治療方案、肺功能、炎癥指標(biāo)等因素之間的關(guān)系,以期對(duì)臨床全面認(rèn)識(shí)和治療CTD-ILD提供依據(jù)；同時(shí)在體外探討肺纖維化的部分機(jī)制。
　　 小窩蛋白-1(eaveolin-1)是21-24Kda大小的細(xì)胞膜嵌蛋白,在體內(nèi)是小窩蛋白的主要組成成分,具

4、有參與胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、膽固醇運(yùn)輸、脂類穩(wěn)定及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)功能。已有研究表明小窩蛋白-1與肺纖維化有關(guān),故本實(shí)驗(yàn)對(duì)小窩蛋白-1在結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變中的表達(dá)及其在TGF-β1誘導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行初步研究,以期更深入了解它在結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變發(fā)病機(jī)制中的作用,并為尋找新的治療靶點(diǎn)提供幫助。
　　 近年來有研究表明CTD—ILD與特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonaryfibrosis,

5、IPF)具有相似的病理特征,即有大量由肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MF)組成的成纖維細(xì)胞灶存在,而MF具有分泌多種細(xì)胞因子,造成細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積,以及誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的凋亡等作用。TGF-β1能誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞(human lung fibroblast,HLF)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,可見其對(duì)肺纖維化的促進(jìn)作用。目前臨床上治療CTD-ILD最常用的藥物是甲強(qiáng)龍(Sou-Medrol,MP)和環(huán)磷酰胺(cyclophos

6、phamide,CTX),但是其機(jī)理還不太明晰,本實(shí)驗(yàn)擬通過體外觀察MP和CTX對(duì)HLF增殖及其對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)HLF分化為MF的影響,探討MP和CTX對(duì)CTD-ILD的作用機(jī)制,為臨床治療CTD-ILD提供理論依據(jù)。
　　 目的和意義：
　　 1.了解CTD-ILD的病理類型與原發(fā)病、穿刺部位影像學(xué)表現(xiàn)、肺功能、治療方案、炎癥指標(biāo)等之間的相互關(guān)系。
　　 2.了解小窩蛋白-1在CTD-ILD患者肺組織中的表達(dá)

7、,并在體外對(duì)其在肺纖維化中的作用進(jìn)行探討。
　　 3.通過體外實(shí)驗(yàn),探討甲強(qiáng)龍與環(huán)磷酰胺對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HLF向MF轉(zhuǎn)化的影響。
　　 方法：
　　 1.對(duì)2003年1月至2010年12月于廣東省人民醫(yī)院風(fēng)濕科住院診斷為CTD-ILD并行CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢的45例患者進(jìn)行回顧性分析。將病理類型分為尋常型間質(zhì)性肺炎(usual interstitial pneumonia,UIP)、非特異性間質(zhì)性肺炎(n

8、onspecific interstitial pneumonia,NSIP)及其它型三種,將治療方案分為CTX<12g、CTX≥12g、非CTX三組,將治療效果分為好轉(zhuǎn)、穩(wěn)定、惡化及無法判定四組,記錄穿刺部位的高分辨CT(high resolution computerizedtomography。HRCT)影像學(xué)表現(xiàn)、治療方案及治療前后血沉(erythrocytesedimentation rate,ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-rea

9、ctive protein,CRP)、血小板(platelets,PLT)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、一秒用力呼氣容積(forcedexpiratory volume in one second,FEV1)、一氧化碳彌散量(diffusion capacity forcarbonmonoxide of lung,DLCO)、氧分壓(partial pressure of oxygen,PO2)、二

10、氧化碳分壓(partial pressure of carbondioxide,PCO2)、氧飽和度及肺部感染發(fā)生情況。分析CTD—ILD病理類型與原發(fā)病、穿刺部位HRCT表現(xiàn)、炎癥指標(biāo)、肺功能、動(dòng)脈血?dú)夥治?、治療等之間的關(guān)系。
　　 2.CTD—ILD患者及正常肺組織的冰凍切片進(jìn)行HE染色鑒定后,行小窩蛋白-1、TGF-β1免疫雙熒光染色；正常肺組織行原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定,加入10μg/L TGF-β1誘導(dǎo)HLF24小時(shí),

11、比較誘導(dǎo)前后小窩蛋白-1熒光表達(dá)變化；選用11-20代HLF,以終濃度分別為0、1、3、5、10、15μg/L的TGF-β1誘導(dǎo)24h以及濃度為10μg/L TGF-β1分別誘導(dǎo)0、6、12、24、48h,用熒光定量PCR及Western Blot方法檢測(cè)小窩蛋白-1mRNA及蛋白表達(dá)變化。
　　 3.體外培養(yǎng)原代HLF并傳代,用11—20代細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):以10μg/LTGF-β1誘導(dǎo)HLF向MF轉(zhuǎn)分化。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽法

12、檢測(cè)甲強(qiáng)龍和環(huán)磷酰胺對(duì)HLF的增殖抑制率,用SPSS軟件得出兩藥IC50值作為細(xì)胞單獨(dú)用藥濃度；以此為依據(jù)分為:PBS對(duì)照組(陰性對(duì)照組)、TGF-β1組(10μg/L)(陽(yáng)性對(duì)照組)、TGF-β1+甲強(qiáng)龍組(MP組),TGF-β1+環(huán)磷酰胺組(CTX組)、TGF-β1+甲強(qiáng)龍+環(huán)磷酰胺組(聯(lián)合用藥組)。各組作用于HLF24h,應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)各組α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α—SMA)的表達(dá)。
　　 4.統(tǒng)計(jì)分析:

13、采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。臨床研究:定量資料的描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,分類資料的描述用構(gòu)成比及相應(yīng)人數(shù)；組間比較采用單因素方差分析,兩組定量因素的前后水平差異比較用配對(duì)t檢驗(yàn),多組分類因素構(gòu)成比的差異比較用卡方檢驗(yàn)；不滿足參數(shù)檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析采用Kruskal Wallis非參數(shù)檢驗(yàn),兩分類變量的關(guān)聯(lián)程度用列聯(lián)相關(guān)系數(shù)表示,分類資料的對(duì)應(yīng)關(guān)系用對(duì)應(yīng)分析?；A(chǔ)研究:組間比較采用單因素方差分析,經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn),方差齊時(shí)采用

14、LSD法進(jìn)行多重比較；方差不齊時(shí)用Welch近似方差分析,用Dunnett's T3法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.入選的45例患者包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)7例、原發(fā)性干燥綜合征(primary sjogren syndrome,pSS)11例、多發(fā)性肌炎(polymyolitis,PM)3例、皮肌炎(dermatom

15、ylsitis,DM)5例、系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis,SSc)8例、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)3例、韋格納肉芽腫(Wegener’s Granulomatosis,WG)4例、混合型結(jié)締組織病(mixed connective tissue disease,MCTD)2例、抗合成酶抗體綜合征(anti-synthetase syndrome,ASS)及復(fù)發(fā)性多軟骨炎(rela

16、psing polychondritis,RP)各1例。病理類型的原發(fā)病構(gòu)成不同(P=0.013),SLE、pSS、PM、DM對(duì)應(yīng)的病理類型主要是NSIP,ASS、MCTD、RA的病理類型主要表現(xiàn)為UIP,SSc、RP、WG對(duì)應(yīng)的病理類型主要為其它型。病理類型與穿刺部位HRCT影像學(xué)表現(xiàn)相關(guān)(r=0.545,P=0.043),UIP對(duì)應(yīng)的穿刺部位HRCT表現(xiàn)主要為網(wǎng)格影、磨玻璃影,NSIP對(duì)應(yīng)的主要為斑片影,蜂窩影、結(jié)節(jié)影的病理類型主要

17、為其它型,實(shí)變影的病理類型則表現(xiàn)在3種均可。三種病理類型的炎癥指標(biāo)有不同程度的升高,但它們之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,不同病理類型間的肺功能及動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療方面,不同病理類型間的治療效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.849),發(fā)生肺部感染的機(jī)會(huì)也基本相同(P=0.863)。但不同治療方案間治療效果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005),從好轉(zhuǎn)及穩(wěn)定百分比看,CTX≥12g組要優(yōu)于CTX<12g及非CTX組。隨訪期間有51.1

18、％患者發(fā)生肺部感染,有3名患者因此死亡,其中2例為NSIP、1例為未定型。
　　 2.HE染色結(jié)果顯示:正常對(duì)照組肺組織肺泡、肺間隔結(jié)構(gòu)清晰,無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔增厚等異常病理改變；而CTD-ILD患者組可見肺間隔斷裂或增厚、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡腔內(nèi)分泌物滲出等病理改變。免疫雙熒光染色結(jié)果顯示:小窩蛋白-1、TGF-β1共同表達(dá)于肺間質(zhì)中,與對(duì)照組相比,CTD-ILD患者肺組織TGF—β1表達(dá)增強(qiáng),而小窩蛋白-1表達(dá)減弱。小窩

19、蛋白-1在HLF的胞膜上表達(dá)豐富,經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)可使其表達(dá)減弱,且呈現(xiàn)一定的濃度和時(shí)間依賴趨勢(shì)。與TGF-β10μg/L(對(duì)照組)相比,小窩蛋白-1mRNA.表達(dá)在5、10、15μg/L TGF-β1組均下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)；而小窩蛋白-1的蛋白表達(dá)僅在10、15μg/L TGF-β1組有減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。以TGF-β1作用0h組為對(duì)照,小窩蛋白-1mRNA表達(dá)在TGF—β1作用6h

20、、12h、24h、48h組均有下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)；而小窩蛋白-1蛋白表達(dá)則在TGF-β1作用24h、48h組下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。
　　 3.甲強(qiáng)龍和環(huán)磷酰胺可以抑制HLF的增殖,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系,兩藥的單獨(dú)用藥濃度分別取10-3mg/ml和10-5mg/ml。結(jié)果表明10μg/L的TGF—β1誘導(dǎo)HLF24h后,α-SMA蛋白表達(dá)較PBS對(duì)照組增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

21、0.001)。TGF-β1與單藥MP或CTX共培養(yǎng)24小時(shí)后發(fā)現(xiàn):與PBS陰性對(duì)照組相比,兩單藥組α-SMA的表達(dá)均有增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003、0.020)；但與TGF-β1陽(yáng)性對(duì)照組相比,兩單藥組α-SMA的表達(dá)有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024、0.003)；與聯(lián)合用藥組比較,發(fā)現(xiàn)兩單藥組α-SMA的表達(dá)下降不及聯(lián)合用藥組明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別<0.001、0.001)。但MP及CTX單獨(dú)用藥組之間α

22、-SMA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.327)。聯(lián)合用藥組α-SMA的表達(dá)與PBS對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.207),與tGF-β1對(duì)照組、TGF-β1+MP組、TGF-β1+CTX組相比均有顯著下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為<0.001、<0.001、0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.CTD-ILD患者的病理類型與原發(fā)病、穿刺部位hRCT表現(xiàn)相關(guān),不同病理類型間炎癥指標(biāo)、肺功能、動(dòng)脈血?dú)夥治?、治?/p>

23、效果以及肺部感染發(fā)生機(jī)率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同治療方案間治療效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CtY≥12g組要優(yōu)于CTX<12g及非CTX組。
　　 2.CTD-ILD患者肺組織中的TGF-β1表達(dá)增強(qiáng),小窩蛋白-1表達(dá)減少；TGF-β1誘導(dǎo)可使HLF胞膜上的小窩蛋白-1表達(dá)減弱,并呈現(xiàn)一定的濃度和時(shí)間依賴趨勢(shì),且蛋白的表達(dá)滯后于mRNA的表達(dá),表明TGF-β1誘導(dǎo)的小窩蛋白-1表達(dá)下降可能參與了CTD-ILD的發(fā)生和發(fā)展。