橋本氏甲狀腺炎中IL-23通過抑制細胞自噬誘導ROS累積的研究.pdf

1、目的:
　　本文旨在探討在橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）患者中白細胞介素23（interlukin-23，IL-23）是否參與甲狀腺氧化還原平衡紊亂以及ROS累積，其機制是否與誘導細胞自噬異常有關。
　　方法:
　　1.采用免疫組織化學法檢測10例HT和10例單純結節(jié)性甲狀腺腫患者的甲狀腺組織中IL-23、IL-23R表達。
　　2.采用免疫熒光染色技術觀察經(jīng)不同濃度IFN

2、-γ(250 U/mL、500 U/mL、1000 U/mL)或不同濃度 LPS(0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)或不同濃度TNF-α(10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL)處理后甲狀腺上皮細胞Nthy-ori3-1中IL-23R的表達變化。
　　3．甲狀腺上皮細胞株Nthy-ori3-1用不同濃度IL-23(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)單獨處理或用特異性IL-23中和抗體

3、預處理后再與 IL-23(50 ng/mL)共同處理后，采用免疫熒光以及流式細胞術檢測甲狀腺上皮細胞內(nèi)ROS水平的變化。
　　4.采用免疫組織化學法檢測橋本甲狀腺炎以及單純結節(jié)性甲狀腺腫患者的甲狀腺組織中自噬相關蛋白LC3B、Atg12表達。
　　5． Western blot檢測甲狀腺上皮細胞經(jīng)IL-23(50 ng/mL)單獨處理不同時間(8 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h)或50

4、ng/ml IL-23與其特異性中和抗體(1μg/mL)共同作用后自噬相關蛋白 LC3B、Atg12、p62表達變化。
　　6.采用免疫熒光技術檢測不同濃度IL-23(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)處理甲狀腺上皮細胞24 h后p-mTOR表達變化。
　　7. Western blot檢測甲狀腺上皮細胞經(jīng)IL-23(50 ng/mL)處理不同時間(8 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6

5、 h、12 h)后AKT、p-AKT以及 mTOR、p-mTOR蛋白表達變化。
　　8.甲狀腺上皮細胞在含有或不含有IL-23特異性中和抗體(1μg/mL)預處理的培養(yǎng)基中與IL-23(50 ng/mL)處理后，采用western blot檢測p-mTOR以及mTOR蛋白表達變化。
　　9. Western blot檢測甲狀腺上皮細胞Nthy-ori3-1經(jīng)不同濃度雷帕霉素（10 nM、20 nM、50 nM）處理不同時間段

6、（12 h、24 h）后p-mTOR表達水平變化。
　　10. Western blot檢測細胞經(jīng)IL-23(50 ng/mL)與雷帕霉素(10 nM)不同組合處理后自噬相關蛋白LC3B-II、Atg12以及 p62表達變化。
　　11.采用免疫熒光以及流式細胞術檢測雷帕霉素的加入對甲狀腺上皮細胞內(nèi)ROS表達水平的影響。
　　12.免疫組化檢測橋本甲狀腺炎以及單純結節(jié)性甲狀腺腫患者甲狀腺組織中p-AKT、AKT以及p-

7、mTOR、mTOR的表達。
　　結果:
　　1.橋本氏甲狀腺炎患者甲狀腺組織中IL-23以及IL-23R表達明顯高于正常對照組。
　　2.體外實驗結果顯示，Nthy-ori3-1經(jīng)IFN-γ(250 U/mL、500 U/mL、1000 U/mL)以及LPS（0.1μg/mL、0.5μg/mL濃度）處理后細胞表面IL-23R的表達量均明顯上調(diào)，但不同濃度TNF-α處理組IL-23R表達水平與對照組無明顯差異。
　

8、　3. Nthy-ori3-1經(jīng)不同濃度IL-23處理后其細胞內(nèi)ROS表達水平明顯增強，IL-23中和抗體的加入減少了IL-23誘導的細胞內(nèi)ROS的增加。
　　4.免疫組化結果顯示，在橋本氏甲狀腺炎患者的甲狀腺組織中自噬相關蛋白LC3B、Atg12表達明顯低于正常對照組；體外實驗顯示，甲狀腺上皮細胞經(jīng)IL-23處理后其自噬相關蛋白LC3B、Atg12表達明顯下調(diào)及p62蛋白表達上調(diào)(P<0.01)；相反，IL-23中和抗體的加入使

9、得自噬相關蛋白LC3B(P<0.05)、Atg12(P<0.01)表達明顯上調(diào)及p62表達明顯下調(diào)(P<0.01)。
　　5.免疫熒光結果顯示，IL-23處理甲狀腺上皮細胞后引發(fā)磷酸化mTOR表達水平增加且具有一定濃度依賴性；采用western blot技術在蛋白水平進一步驗證，結果顯示Nthy-ori3-1經(jīng)IL-23處理不同時間后AKT以及mTOR的磷酸化水平明顯上調(diào)(P<0.05)，加入IL-23中和抗體后則p-mTOR表達

10、水平明顯下降(P<0.05)。
　　6. Western blot結果顯示，10 nM雷帕霉素處理甲狀腺上皮細胞24 h時，明顯下調(diào)了mTOR以及p-mTOR水平。
　　7. Western blot結果顯示，與IL-23單獨處理組相比，雷帕霉素的加入使得自噬相關蛋白LC3B、Atg12表達明顯上調(diào)及p62蛋白表達明顯下調(diào)；免疫熒光以及流式細胞術結果顯示，與IL-23單獨處理組相比，雷帕霉素的加入明顯下調(diào)了ROS的表達（P<

11、0.01)。
　　8.免疫組化結果顯示，與健康對照組相比，橋本氏甲狀腺炎患者的甲狀腺上皮細胞中p-AKT以及p-mTOR表達水平明顯上調(diào)，然而在正常對照組以及橋本甲狀腺炎患者中總的AKT以及mTOR表達水平?jīng)]有明顯的差異。
　　結論：
　　綜上所述，我們的結果顯示橋本甲狀腺炎患者的甲狀腺上皮細胞中IL-23表達明顯增高；IL-23通過活化AKT/mTOR信號通路抑制甲狀腺上皮細胞自噬活性，自噬的抑制導致ROS水平的累積