核糖體蛋白S3a抑制內(nèi)毒素誘導的炎癥作用及協(xié)同商陸皂苷甲抗炎作用的研究.pdf

1、目的:研究具有抗炎作用的商陸皂苷甲(Esculentoside A，EsA)細胞內(nèi)結(jié)合蛋白核糖體蛋白RPS3a與炎癥的關系;并進一步研究商陸皂苷甲的抗炎作用機制及與RPS3a的關系，為炎癥相關疾病治療提供新的思路
　　 方法:應用RT-PCR從人胚腎HEK293細胞的總RNA中反轉(zhuǎn)錄并擴增出RPS3a基因，并將RPS3a亞克隆到穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV中，酶切及測序鑒定后，再將含RPS3a基因的重組穿梭質(zhì)粒pShuttl

2、e-CMV-RPS3a進行PmeⅠ酶線性化處理，轉(zhuǎn)化到含有骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)菌，進行同源重組;將質(zhì)粒pAd-RPS3a PacⅠ酶切線性化，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中進行病毒包裝，通過綠色熒光觀察病毒包裝表達情況，病毒包裝成功后用HEK293細胞進行滴度測定。在不同細胞上驗證RPS3a的表達，根據(jù)相同的MOI加入Ad-RPS3a和Ad-GFP，Western Blot印跡實

3、驗鑒定;建立內(nèi)毒素(LPS)刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7的炎癥模型，ELISA和Griess法檢測細胞上清炎癥相關介質(zhì)TNF-α、IL-10和NO的含量，Western Blot檢測與細胞因子產(chǎn)生密切相關的NFκB信號通路、MAPK信號通路、AKT信號通路和STAT3信號通路蛋白的含量;LPS建立急性炎癥致死性小鼠模型，觀察RPS3a高表達對小鼠生存率的影響。
　　 結(jié)果:成功克隆出RPS3a目的片段，插入到穿梭質(zhì)粒pShu

4、ttle-CMV重組為pShuttle-CMV-RPS3a，經(jīng)SalⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定和序列測定證明目的片段正確。穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-RPS3a在含有骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183細菌內(nèi)同源重組產(chǎn)生腺病毒質(zhì)粒pAd-RPS3a，質(zhì)粒pAd-RPS3a經(jīng)PacⅠ酶切和PCR鑒定重組成功;將線性化腺病毒重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞包裝成腺病毒，擴增后滴度可達1011pfu/ml;經(jīng)Western Blot驗證感

5、染AdRPS3a的人胚腎293細胞、NIH3T3細胞、大鼠肝星狀細胞HSC-T6細胞RPS3a蛋白水平表達均升高;RPS3a高表達的巨噬細胞RAW164.7能夠顯著抑制LPS刺激產(chǎn)生的NO、TNF-α，而升高抗炎因子IL-10含量; Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)RPS3a高表達能抑制LPS誘導升高的p-ERK、p-JNK和p-P38水平;AdRPS3a能抑制LPS刺激升高的p-Iκ B水平，但對LPS誘導降低的Iκ B水平無影響;R