探討海珠益肝加味方對(duì)免疫性肝損傷小鼠腸-肝軸及腸道菌群的干預(yù)作用.pdf

1、目的：
　　本研究基于對(duì)中醫(yī)經(jīng)典理論“肝脾同治”以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“腸-肝軸”學(xué)說(shuō)的充分認(rèn)識(shí)，探討海珠益肝加味方對(duì)ConA(Concanavalin A,刀豆蛋白A)誘導(dǎo)的慢性免疫性肝損傷小鼠肝臟Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及腸道功能的影響，探明慢性免疫性肝損傷與腸黏膜功能、內(nèi)毒素水平以及腸道菌群間的關(guān)系，明確腸道功能在慢性肝炎發(fā)生、發(fā)展中的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析這一過(guò)程中所涉及的關(guān)鍵信號(hào)通路,進(jìn)一步揭示“肝脾同治”和“腸-肝軸”的科學(xué)內(nèi)涵

2、，為慢性乙型肝炎的防治提供新思路和新策略。
　　方法：
　　小鼠48只，隨機(jī)分為4組，空白對(duì)照組、模型組、甘草酸二銨組、海珠益肝加味方組各12只。模型組、甘草酸二銨組、海珠益肝加味方組采用6mg·kg-1 w-1的劑量尾靜脈注射Con A，共6周，復(fù)制慢性免疫性肝損傷模型。模型復(fù)制后甘草酸二銨組小鼠以甘草酸二銨0.68g·kg-1d-1的劑量灌胃給藥，海珠益肝加味方組小鼠以海珠益肝加味方15.17g·kg-1d-1的劑量灌胃

3、給藥，空白對(duì)照組及模型組予以等劑量的蒸餾水灌胃，每日9a.m.和3p.m.分兩次灌胃，連續(xù)4周。灌胃給藥結(jié)束后，當(dāng)日夜間禁食，次日清晨采集各組小鼠糞便標(biāo)本，繼而采集血液和肝臟、回腸等組織標(biāo)本。
　　測(cè)定各組小鼠血清ALT(alanine aminotransferase,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST(aspartate aminotransferase,天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)和TBIL(total bilirubin,總膽紅素)水平

4、；取肝臟組織作病理學(xué)切片，進(jìn)行HE染色評(píng)定肝組織病損積分；取回腸組織作病理學(xué)切片，進(jìn)行HE染色在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腸黏膜病損情況；以電子顯微鏡對(duì)各組小鼠肝組織進(jìn)行超微病理學(xué)觀察；ABC-ELIASA法檢測(cè)血清中TNF-α（tumor necrosis factor-α,腫瘤壞死因子-α）、IL-6（interleukin-6,白細(xì)胞介素-6）及LBP(LPS binding protein,脂多糖結(jié)合蛋白)的水平；鱟試劑顯色基質(zhì)法

5、測(cè)定血漿內(nèi)毒素水平；Western blot(免疫印跡試驗(yàn))法檢測(cè)小鼠肝組織中TLR4(Toll-like receptor-4,Toll樣受體4)、MyD88(mye loid ddifferentiation factor88,髓樣分化因子-88)、NF-κB(nuclea r factor-K-gene binding，基因結(jié)合核因子)蛋白表達(dá)；RealTime-PCR檢測(cè)小鼠肝臟組織中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、N

6、F-κB mRNA以及腸道關(guān)鍵菌群-- ENco（Enterococcus，腸球菌）、E.coli（Enterobacteriacea e，腸桿菌）、Bifi（Bifidobacterium，雙歧桿菌）、Lacto（Lactobacil lus，乳酸桿菌）的含量。
　　結(jié)果:
　　1．ALT、AST、TBiL情況：與空白對(duì)照組比較，模型組、甘草酸二銨組、海珠益肝加味方組小鼠血清ALT、AST、TBiL水平均升高(P均<0.0

7、5)；與模型組比較，甘草酸二銨組、海珠益肝加味方組血清ALT、AST、TBiL水平均降低(P均<0.05)；與甘草酸二銨組比較，海珠益肝加味組在降低小鼠血清TBiL水平方面優(yōu)于甘草酸二銨(P<0.05)，但ALT下降水平不及甘草酸二銨組(P<0.05)，兩組AST水平未見(jiàn)明顯差異(P<0.05)。
　　2.病理組織學(xué)變化：光學(xué)顯微鏡下顯示，模型組小鼠肝臟淤血，匯管區(qū)大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝板消失，肝細(xì)胞排列紊亂；與模型組比較，甘草酸

8、二銨組和海珠益肝加味方組在減輕肝組織病損積分方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在肝臟超微結(jié)構(gòu)上，模型組肝細(xì)胞核固縮，胞膜形態(tài)不完整，胞質(zhì)疏松，線(xiàn)粒體腫脹，嵴模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；甘草酸二銨組和海珠益肝加味方組在以上方面均較模型組有所改善。小鼠回腸組織病理學(xué)顯示，模型組小鼠回腸黏膜固有層變薄，上皮細(xì)胞變性脫落，絨毛水腫，排列紊亂，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增多；甘草酸二銨組和海珠益肝加味方組在以上方面均較模型組有顯著改善。
　　3．TNF-α、I

9、L-6的表達(dá)：模型組、甘草酸二銨組、海珠益肝加味方組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)；與模型組比較，甘草酸二銨組小鼠血清TNF-α水平下降(P<0.05)，而IL-6水平明未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)；與模型組比較，海珠益肝加味方組TNF-α、IL-6水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與甘草酸二銨組比較,海珠益肝方加味組IL-6水平下降(P<0.05)，TNF-α水平未見(jiàn)差異(P＞0.0

10、5)。
　　4．內(nèi)毒素、LBP水平：與空白對(duì)照組比較，模型組、甘草酸二銨組小鼠內(nèi)毒素和LBP水平明顯升高(P均<0.05)；與模型組比較，甘草酸二銨組小鼠內(nèi)毒素和LBP水平未見(jiàn)明顯差異(P均＞0.05)；與模型組比較，海珠益肝加味方組LBP和內(nèi)毒素水平均降低(P均<0.05)。與甘草酸二銨組比較,海珠益肝方加味組小鼠血漿LBP、LPS水平降低(P均<0.05)。
　　5．肝組織TLR4-MyD88-NF-κB通路的蛋白表達(dá)及

11、轉(zhuǎn)錄水平：模型組肝組織TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯升高(P均＜0.05)；與模型組比較，甘草酸二銨組，TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降(P均＜0.05)；與模型組比較，海珠益肝加味方組肝組織TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平均下降(P＜0.05)。與甘草酸二銨組相比，海珠益肝加味方組MyD88蛋白表達(dá)水平及TLR4、NF-κBmRNA轉(zhuǎn)錄水平下

12、降(P均<0.05)，余未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。
　　6．腸道菌群水平：模型組小鼠腸道菌群中雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量較空白對(duì)照組下降，而腸桿菌、腸球菌的數(shù)量增加(P＜0.05)；在甘草酸二銨的干預(yù)下腸桿菌、腸球菌的數(shù)量較模型組降低(P＜0.05)；在海珠益肝加味方的干預(yù)下腸桿菌、腸球菌的數(shù)量較模型組降低，雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量增加(P＜0.05)。與甘草酸二銨組相比海珠益肝加味方組小鼠腸道菌群中雙歧桿菌數(shù)量增加，腸桿菌、腸

13、球菌的數(shù)量下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　以“肝脾同治”為法的海珠益肝加味方在降低轉(zhuǎn)氨酶（ALT、AST）和膽紅素(TBIL)方面具有良好作用。同時(shí)海珠益肝加味方能夠減輕肝組織和回腸組織的病理?yè)p傷程度，其抗慢性免疫性肝損傷的作用機(jī)制可能為：
　　1．海珠益肝加味方可能是通過(guò)抑制TLR4、MyD88和NF-κB的表達(dá)，從而調(diào)控 TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路，降低TNF-α、IL-6水平，減少促炎因子的