小鼠肝臟免疫系統(tǒng)對(duì)自身免疫性肝損傷的調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、小鼠肝臟免疫系統(tǒng)對(duì)自身免疫性肝損傷的調(diào)節(jié)機(jī)制生命科學(xué)學(xué)院博士研究生王靜導(dǎo)師田志剛教授肝臟作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，實(shí)時(shí)抵御外源抗原的攻擊。同時(shí)，肝臟的免疫系統(tǒng)還具備精細(xì)的調(diào)節(jié)功能，以使在肝臟內(nèi)發(fā)生的免疫耐受和免疫應(yīng)答達(dá)到最適的動(dòng)態(tài)平衡。肝臟免疫系統(tǒng)的組成不同于其他組織，它包含了眾多的固有天然免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞。這些細(xì)胞群體大量聚集在肝臟中，表明它們?cè)诟闻K生物學(xué)中具有重要的地位，能夠?yàn)闄C(jī)體提供抵抗外來抗原入侵

2、的免疫監(jiān)視及保護(hù)作用。當(dāng)這些免疫細(xì)胞功能表現(xiàn)異常時(shí)，將破壞肝臟內(nèi)原有的免疫平衡，從而誘發(fā)一系列的肝臟病理損傷。然而，現(xiàn)階段關(guān)于這些細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，及其在肝臟疾病過程中的作用機(jī)制尚不清楚。有鑒于此，本課題將著重探討肝臟NK細(xì)胞和NKT/T細(xì)胞之間的作用關(guān)系對(duì)小鼠自身免疫性肝損傷的調(diào)節(jié)機(jī)制。 為實(shí)現(xiàn)以上研究目的，我們選用了ConA和polyI：C兩種免疫激活劑。實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用不同的聯(lián)合注射方式處理小鼠，以分別激活體內(nèi)NKT/T細(xì)

3、胞和NK細(xì)胞，并觀察了在肝臟損傷過程中細(xì)胞間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。ConA(concanavalinA)是一種T細(xì)胞多克隆刺激劑，通常被用來建立小鼠肝臟損傷模型。高劑量ConA注射可誘導(dǎo)爆發(fā)性肝炎，這類肝損傷由活化的T細(xì)胞介導(dǎo)，NKT細(xì)胞以及一些炎癥細(xì)胞因子例如TNF-α和IFN-γ也在此過程中行使重要的效應(yīng)功能。另一方面，低劑量ConA處理能夠誘導(dǎo)肝臟纖維化的發(fā)生和增強(qiáng)肝臟的抗腫瘤免疫應(yīng)答，表明ConA可以作為一類T細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑來對(duì)肝臟免疫

4、應(yīng)答行使調(diào)節(jié)功能。另一刺激劑polyI：C(polyinosinic-polycytidylicacid)因其自身結(jié)構(gòu)與雙鏈病毒RNA類似，所以它所引發(fā)的一系列免疫反應(yīng)與病毒感染有某些相似之處。PolyI：C可以高度活化NK細(xì)胞并增強(qiáng)NK細(xì)胞的天然免疫功能，同時(shí)還能夠募集大量的NK細(xì)胞遷移至肝臟內(nèi)，表明polyI：C是肝臟NK細(xì)胞的一類強(qiáng)有力的激活劑，它能夠通過激活TLR3(tolllikereceptor3)分子相關(guān)的信號(hào)通路來引發(fā)下

5、游的免疫應(yīng)答。由此可見，實(shí)驗(yàn)中選用ConA和polyI：C處理小鼠，可以分別活化肝臟NKT/T細(xì)胞和NK細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)我們對(duì)這些細(xì)胞間相互調(diào)節(jié)作用的研究。 實(shí)驗(yàn)過程中，我們采用賴氏法檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶水平、定量ELISA法檢測(cè)血清細(xì)胞因子水平，以及組織染色方法觀察肝臟病理學(xué)變化，并利用以上指標(biāo)綜合評(píng)估肝臟損傷；通過細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)輸和抗體清除實(shí)驗(yàn)，研究特定淋巴細(xì)胞群在肝臟損傷過程中的作用以及細(xì)胞間相互作用關(guān)系；采用流式細(xì)胞術(shù)精確測(cè)定各淋巴細(xì)

6、胞亞群的表型，并對(duì)其活化狀態(tài)和細(xì)胞因子分泌功能進(jìn)行分析。此外，運(yùn)用transwell細(xì)胞培養(yǎng)體系、特異抗體阻斷實(shí)驗(yàn)以及特定基因缺陷小鼠，探討了細(xì)胞間可能存在的相互作用方式。通過上述研究方案獲得了如下結(jié)果： 1.TLR3配體促進(jìn)了脾臟NK細(xì)胞向肝臟聚集實(shí)驗(yàn)采用TLR3的配體polyI：C，注射小鼠，觀察了體內(nèi)NK細(xì)胞在肝臟、脾臟、骨髓、胸腺和肺臟中的分布變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常小鼠肝臟NK細(xì)胞比例為8.55±1.05％，而在poly

7、I：C注射后這一比例增加至38.96±2.03％，同時(shí)肝臟NK細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量也有顯著增加。此外，polyI：C注射降低了NK細(xì)胞在脾臟中的聚集，而在其他器官中此類細(xì)胞在注射前后并沒有發(fā)生明顯的變化。通過脾臟轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)與其他被轉(zhuǎn)輸?shù)牧馨图?xì)胞相比，NK細(xì)胞在肝臟聚集的比例最高，而切除小鼠脾臟可以明顯降低polyI：C注射后肝臟NK細(xì)胞的數(shù)目。同時(shí)，T細(xì)胞的缺失也能夠抑制NK細(xì)胞向肝臟的回流及其在肝臟中的活化。此外，RT-PCR結(jié)果顯

8、示NK細(xì)胞的遷移過程還伴隨著肝臟中趨化因子FRK(fractalkine)和粘附分子VCAM-1(vascularcelladhesionmolecule-1)表達(dá)量的上升。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明polyI：C刺激能夠使從脾臟遷移出來的NK細(xì)胞較特異性地遷移至肝臟，從而顯著增加了肝臟NK細(xì)胞的比例和數(shù)目。同時(shí)，NK細(xì)胞向肝臟遷移的過程還受到趨化因子、粘附分子和T細(xì)胞的多重調(diào)控。 2.預(yù)活化的NK細(xì)胞負(fù)向調(diào)節(jié)肝臟T細(xì)胞并抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的

9、肝炎低劑量的polyI：C預(yù)處理能夠減輕高劑量ConA注射所誘發(fā)的小鼠肝損傷。在ConA注射后24小時(shí)，血清轉(zhuǎn)氨酶ALT水平達(dá)到7137±1069IU/L，而經(jīng)polyI：C預(yù)注射后ALT水平降低至346±62IU/L。此外，polyI：C預(yù)注射還可以減輕肝臟病理損傷和延長(zhǎng)致死劑量ConA注射后小鼠的生存時(shí)間。同時(shí)，polyI：C預(yù)注射也顯著性地降低了血清中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-4水平，以及肝臟NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和T細(xì)

10、胞分泌細(xì)胞因子的功能。通過細(xì)胞清除和細(xì)胞轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)清除了體內(nèi)NK細(xì)胞后，polyI：C預(yù)注射對(duì)ConA引起的肝炎沒有明顯的作用，而轉(zhuǎn)輸活化的NK細(xì)胞又能有效地抑制肝臟損傷的發(fā)生，表明po1yI：C預(yù)注射對(duì)ConA誘導(dǎo)的肝損傷的抑制作用依賴于活化的NK細(xì)胞。此外，低劑量polyI：C注射能明顯降低肝臟內(nèi)NKT細(xì)胞和T細(xì)胞的數(shù)目，相反地卻大大增加了NK細(xì)胞在肝臟的聚集程度：與正常組相比，肝臟內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)目增加了近5倍。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)

11、果顯示polyI：C注射增加了肝臟NKT細(xì)胞和T細(xì)胞表面凋亡分子AnnexinV和Fas的表達(dá)，并提高了殺傷分子FasL(Fasligand)在NK細(xì)胞上的表達(dá)量。而在經(jīng)過polyI：C體外刺激的細(xì)胞培養(yǎng)體系中，抗體阻斷FasL可以降低NKT細(xì)胞和T細(xì)胞中AnnexinV+細(xì)胞的比例。另外，經(jīng)polyI：C注射的Fas-/-和FasL-/-缺陷小鼠的肝臟NKT細(xì)胞數(shù)目明顯多于野生型對(duì)照組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明polyI：C活化的NK細(xì)胞能通

12、過Fas/FasL的相互作用負(fù)向調(diào)節(jié)NKT細(xì)胞和T細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮其抗肝臟損傷的作用。 3.預(yù)活化的T細(xì)胞正向調(diào)節(jié)NK細(xì)胞并加重NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟損傷我們之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)高劑量polyI：C注射后可以引起NK細(xì)胞的高度活化，并且特異性地向肝臟聚集。同時(shí)，機(jī)體表現(xiàn)出血清轉(zhuǎn)氨酶水平的增加，以及肝臟中相應(yīng)的輕微炎癥浸潤(rùn)和病理損傷。通過細(xì)胞清除實(shí)驗(yàn)也已證明這種輕微的肝損傷是依賴于NK細(xì)胞的。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)低劑量ConA預(yù)注射小

13、鼠能夠明顯加重polyI：C引起的肝臟損傷。在polyI：C注射后24小時(shí)，血清轉(zhuǎn)氨酶水平從170±22IU/L增加至1460±215IU/L，同時(shí)血清中IFN-γ水平也大幅度增加，肝臟內(nèi)出現(xiàn)大面積的壞死區(qū)域。此外，ConA預(yù)注射還大大增加了polyI：C注射后肝臟NK細(xì)胞的數(shù)目，同時(shí)也增強(qiáng)了NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力和細(xì)胞殺傷功能。當(dāng)清除了小鼠體內(nèi)T細(xì)胞后，ConA預(yù)注射對(duì)肝臟損傷的加重作用被明顯削弱，而轉(zhuǎn)輸ConA預(yù)先活化的T細(xì)胞又

14、可以加重polyI：C誘導(dǎo)的肝損傷。 低劑量ConA注射能夠快速活化肝臟中的T細(xì)胞和NK細(xì)胞，但在活化時(shí)相上T細(xì)胞早于NK細(xì)胞，而NK細(xì)胞維持高度活化狀態(tài)的時(shí)間明顯長(zhǎng)于T細(xì)胞。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)T細(xì)胞缺失時(shí)，NK細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌能力都明顯降低，而當(dāng)培養(yǎng)體系中加入活化的T細(xì)胞，并與NK細(xì)胞進(jìn)行混合細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的活化被明顯加強(qiáng)；而當(dāng)這兩類細(xì)胞在transwell板內(nèi)進(jìn)行隔離培養(yǎng)時(shí)，NK細(xì)胞的活化受到明顯抑制。

15、以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ConA預(yù)活化的肝臟T細(xì)胞可能通過細(xì)胞接觸的方式正向調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能，從而加重肝臟損傷。 綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)polyI：C能夠快速激活NK細(xì)胞，并在趨化因子、粘附分子和T細(xì)胞的協(xié)助下，促使NK細(xì)胞特異性地向肝臟遷移；(2)經(jīng)polyI：C活化的NK細(xì)胞能夠通過Fas/FasL作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而負(fù)向調(diào)節(jié)肝臟NKT細(xì)胞和T細(xì)胞，進(jìn)而抑制了ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞所介導(dǎo)的肝損傷；(3)經(jīng)ConA活化的T細(xì)胞能夠正