海珠益肝加味方對(duì)免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:在我國(guó)慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B CHB)的防治雖然取得了一定的進(jìn)步，但現(xiàn)狀并不是樂(lè)觀，約10％～20％慢性乙型病毒性肝炎可發(fā)展為肝硬化，1％～5％慢性乙型病毒性肝炎可演變?yōu)楦伟?，CHB的防治形勢(shì)依然嚴(yán)峻。因此慢性乙型病毒性肝炎仍然是我國(guó)突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題。在慢性乙型病毒性肝炎治療方面，干擾素和核苷類(lèi)似物無(wú)疑是首要選擇，但是干擾素難以適應(yīng)的副作用、基本上需要終身服用的核苷類(lèi)似物限制自身的使用，很顯然

2、應(yīng)用干擾素和核苷類(lèi)似物抗乙肝病毒不能解決慢乙肝患者的所有問(wèn)題。中醫(yī)藥的免疫功能調(diào)節(jié)治療無(wú)疑是積極防治慢性乙型病毒性肝炎的有效方法。近些年來(lái)，已經(jīng)有許多臨床治療慢性乙型病毒性肝炎的中藥單體或者復(fù)方，但其調(diào)節(jié)免疫功能機(jī)理都不是十分清楚。海珠益肝加味方是導(dǎo)師盛國(guó)光教授在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，經(jīng)過(guò)多年臨床驗(yàn)證和實(shí)驗(yàn)研究，在海珠益肝方的基礎(chǔ)不斷優(yōu)化的純中藥復(fù)方制劑。海珠益肝加味方由葉下珠、白花蛇舌草、茯苓、海藻、白芥子、莪術(shù)、枸杞、太子參八味藥組成的經(jīng)

3、驗(yàn)方。具有解毒、化痰、消瘀、補(bǔ)虛的功效。早期研究提示海珠益肝加味方可能通過(guò)某些途徑、環(huán)節(jié)和靶點(diǎn)達(dá)到雙向調(diào)節(jié)免疫功能的作用，其作用機(jī)制很有待于進(jìn)行深入研究。本課題以免疫肝損傷小鼠動(dòng)物模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)海珠益肝加味方進(jìn)行研究，觀察中藥復(fù)方海珠益肝方加味方對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的免疫狀態(tài)、脾細(xì)胞細(xì)胞因子的mRNA基因表達(dá)、輔助性T淋巴細(xì)胞Th1/Th2、To(ll)樣受體(TLR)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，并運(yùn)用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和綜合分析，探討

4、海珠益肝加味方對(duì)免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)一步提高慢性乙型病毒性肝炎的臨床治療水平。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)分五個(gè)部分進(jìn)行
　　 第一部分:海珠益肝方及其擴(kuò)方對(duì)Concanavalin A（刀豆蛋白A）誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。
　　 清潔級(jí)昆明小鼠100只，隨機(jī)分為空白組(1)、模型組(2)、醋酸強(qiáng)的松組(3)、海珠益肝方組(4)、海珠益肝方加太子參枸杞子組(5)、海珠益肝方加太子參仙靈脾組

5、(6)、海珠益肝方加枸杞子仙靈脾組(7)、葉下珠白花蛇舌草組(8)、海藻茯苓白芥子組(9)及莪術(shù)組(10)，每組10只，采用刀豆蛋白A尾靜脈注射法制作免疫性肝損傷動(dòng)物模型。造模前12天，模型組、空白組給予蒸餾水灌胃，其余組每日分別給予醋酸潑的松、海珠益肝全方、海珠益肝方加太子參枸杞子、海珠益肝方加太子參仙靈脾、海珠益肝方加枸杞子仙靈脾、葉下珠白花蛇舌草、海藻茯苓白芥子及莪術(shù)灌胃。末次灌胃給藥后1h，空白組給予生理鹽水10ml/kg尾靜脈

6、注射，其余各組按照20mg/kg尾靜脈注射刀豆蛋白A造模，禁食自由飲水。造模給藥8h后頸椎脫臼處死動(dòng)物摘取肝臟和脾臟，生理鹽水中清洗后稱(chēng)記重量，計(jì)算肝脾指數(shù)。肝組織標(biāo)本勻漿離心后取上清液檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)的值。另外取0.2g肝組織固定、脫水、石蠟包埋、切片后行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。
　　 第二部分:海珠益肝方加味方對(duì)Co

7、n A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠血清IL-4、IL-6、INF-γ、TNF-α的影響。
　　 清潔級(jí)昆明小鼠40只，隨機(jī)分為空白組(1)、模型組(2)、醋酸強(qiáng)的松組(3)、海珠益肝加味方組(4)，每組10只，采用刀豆蛋白A尾靜脈注射法制作免疫性肝損傷模型。造模前12天，模型組、空白組給予蒸餾水灌胃，其余組每日分別給予醋酸強(qiáng)的松、海珠益肝加味方灌胃。末次灌胃給藥后1h，空白組給予生理鹽水10ml/kg尾靜脈注射，其余各組按照20mg/k

8、g尾靜脈注射刀豆蛋白A造模，禁食自由飲水。造模給藥8h后摘眼球取血，離心后留取血清。采用ELISA方法測(cè)定小鼠血清IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的值。
　　 第三部分:海珠益肝方加味方對(duì)Con A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠肝組織病理變化及肝組織NF-KP65的表達(dá)水平的影響。
　　 清潔級(jí)昆明小鼠40只，隨機(jī)分為正常組(1)、模型組(2)、醋酸強(qiáng)的松組(3)、海珠益肝加味方組(4)，每組10只，采用Con A尾靜脈

9、注射法制作免疫性肝損傷模型。造模給藥8h后處死小鼠，取肝組織制作肝臟的超微病理切片，采用電鏡透射法觀察各組肝細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的病理變化，同時(shí)取肝組織用Western-blot法測(cè)定小鼠肝組織NF-KP65的表達(dá)水平。
　　 第四部分:海珠益肝方加味方對(duì)Con A（刀豆蛋白A）誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠脾組織IL-6、TNF-αmRNA影響。
　　 清潔級(jí)昆明小鼠40只，隨機(jī)分為空白組(1)、模型組(2)、醋酸強(qiáng)的松組(3)、海珠

10、益肝加味方組(4)，每組10只，采用刀豆蛋白A尾靜脈注射法制作免疫性肝損傷小鼠模型。采用RT-PCR法測(cè)定小鼠脾組織IL-6、TNF-αmRNA的表達(dá)。
　　 第五部分:海珠益肝方加味方對(duì)Concanavalin A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠肝組織TLR4、CD14 mRNA影響。
　　 清潔級(jí)昆明小鼠40只，隨機(jī)分為空白組(1)、模型組(2)、醋酸強(qiáng)的松組(3)、海珠益肝加味方組(4)，每組10只，采用刀豆蛋白A尾靜脈注射法

11、制作免疫性肝損傷模型。采用RT-PCR法測(cè)定小鼠肝組織TLR4、CD14mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:海珠益肝方及其擴(kuò)方對(duì)Con A（刀豆蛋白A）誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。
　　 1.成功建立小鼠免疫性肝損傷模型。與正常組比較，模型組小鼠肝脾指數(shù)、肝組織勻漿后上清液ALT、AST水平及MDA含量均明顯升高(P＜0.05)，肝組織勻漿后上清液SOD水平明顯降低。模型組肝組織內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)

12、，部分匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝板消失、凋亡小體散在、肝細(xì)胞成脂肪樣變性。血管周?chē)母渭?xì)胞胞漿疏松，染色明顯變淺，肝竇間隙明顯增寬，肝索消失，可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 2.與模型組比較，對(duì)照組和海珠益肝方加味各組可降低小鼠肝脾指數(shù)，降低肝組織ALT、AST水平及MDA含量，提高肝組織的SOD水平(P＜0.05)，其中以海珠益肝加太子參、枸杞子組更明顯。另外與模型組比較，海珠益肝方加味組肝臟病理變化有不同程度減輕。
　

13、　 第二部分:海珠益肝方加味方對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠血清IL-4、IL-6、INF-γ、TNF-α的影響。
　　 1.與正常組比較，模型組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α的水平明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05)。模型組小鼠血清IL-4、IL-6的水平明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 2.與模型組比較，對(duì)照組和海珠益肝方加味組血清中IFN-γ、TNF-α的水平明顯降低，差異有顯著性(P

14、＜0.05)。對(duì)照組和海珠益肝方加味方組小鼠血清中IL-6的水平明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05)。對(duì)照組和海珠益肝方加味方組小鼠血清中IL-4的水平明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 第三部分:海珠益肝方加味方對(duì)Con A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠肝組織病理變化及肝組織NF-KP65的表達(dá)水平的影響。
　　 1.正常組肝細(xì)胞核呈圓形及卵圓形，核膜光滑平整，染色質(zhì)均勻分布在核內(nèi)。模型組肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松

15、，出現(xiàn)深淺不一的切跡，胞質(zhì)中常見(jiàn)髓樣體及空泡變性區(qū)，線粒體腫脹，嵴模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張。與模型組比較，對(duì)照組和海珠益肝方加味組肝細(xì)胞腫脹明顯減輕，未見(jiàn)明顯毛細(xì)膽管擴(kuò)張，線粒體輕度腫脹，嵴存在，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)明顯擴(kuò)張。
　　 2.與正常組比較，模型組NF-KP65的水平明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P＜0.05);與模型組比較，對(duì)照組和海珠益肝方加味組NF-KP65的水平有明顯變化，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P＜0.05)。
　　 第四部

16、分:海珠益肝方加味方對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠小鼠脾組織IL-6、TNF-αmRNA影響。
　　 1.與正常組比較，模型組IL-6 mRNA的水平有明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P＜0.05);與正常組比較，模型組TNF-αmRNA的水平顯著升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P＜0.05)。
　　 2.與模型組比較，對(duì)照組和海珠益肝方加味組IL-6 mRNA的水平明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P＜0.05)。與模型組比較，對(duì)照組

17、和海珠益肝方加味組TNF-αmRNA的水平明顯下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P＜0.05)。
　　 第五部分:海珠益肝方加味方對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠肝組織TLR4、CD14 mRNA影響。
　　 1.與正常組比較，模型組TLR4 mRNA的表達(dá)水平明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.05);與模型組比較，對(duì)照組和海珠益肝方加味組TLR4 mRNA的表達(dá)水平明顯升高，具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 2.與

18、正常組比較，模型組CD14 mRNA的水平無(wú)明顯變化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無(wú)顯著性差異(P＞0.05);與模型組比較，對(duì)照組和海珠益肝方加味組CD14 mRNA的水平無(wú)明顯變化，未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、海珠益肝方加味對(duì)免疫性肝損傷小鼠的肝臟功能有較好的保護(hù)作用。
　　 2、海珠益肝方加味對(duì)免疫性肝損傷小鼠的肝臟功能有較好的保護(hù)作用的機(jī)制可能是維持Th1/Th2之間的平衡;抑制過(guò)抗的脾臟的細(xì)