模擬微重力WB-F344肝干細(xì)胞三維培養(yǎng)研究.pdf

1、捐贈(zèng)肝臟的缺乏、肝細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖能力有限、沒有合適的肝細(xì)胞凍存條件等，都給肝病的細(xì)胞治療帶來極大困難。肝干細(xì)胞具有自我更新和多潛能性，因此可能成為肝病細(xì)胞治療以及組織工程理想的細(xì)胞來源。本文以大鼠肝干細(xì)胞系WB-F344為實(shí)驗(yàn)材料，采用RCCS系統(tǒng)模擬微重力效應(yīng)，并以Cytodex-3為微載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)(以平面培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照)，分析微重力三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞形態(tài)、增殖、細(xì)胞內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞粘附分子表達(dá)情況；檢測了細(xì)胞膜流動(dòng)性與肝

2、干細(xì)胞標(biāo)記分子甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)RNA及蛋白水平表達(dá)變化；將兩種培養(yǎng)條件下的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)和體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)，分析模擬微重力三維培養(yǎng)條件下WB-F344細(xì)胞生長、體外及體內(nèi)分化潛能等，旨在為肝組織工程及臨床應(yīng)用建立理想的體外細(xì)胞模型奠定基礎(chǔ)。 通過光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察、透射電鏡觀察細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞計(jì)數(shù)分析細(xì)胞生長狀態(tài)及流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞周期等分析了微重力條件下WB-F344細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果表明，

3、微重力三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞貼壁于微載體上并且相互連接，細(xì)胞貼壁良好，折光性強(qiáng)，生長呈現(xiàn)三維立體排列方式；細(xì)胞纖維結(jié)構(gòu)呈緊密多層排列、可見豐富的微絨毛和線粒體、胞間有橋粒和緊密連接形成，細(xì)胞粘著力加強(qiáng)、表現(xiàn)出良好的三維生長特征；與平面對(duì)照組相比，微重力三維條件下WB-F344細(xì)胞生長增殖速度快；在培養(yǎng)的6d，發(fā)現(xiàn)微重力三維細(xì)胞G0/G1和S期的比例增加，而G2/M期細(xì)胞比例顯著減少(P＜0.05)。 通過熒光偏振法檢測細(xì)胞膜流動(dòng)性變

4、化，結(jié)果表明，與平面培養(yǎng)的細(xì)胞相比，微重力三維培養(yǎng)的細(xì)胞膜熒光偏振度與生物膜粘度下降，說明細(xì)胞膜流動(dòng)性增加。采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞各種粘附分子、流式細(xì)胞術(shù)檢測鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達(dá)情況。結(jié)果微重力三維培養(yǎng)和平面培養(yǎng)下，各種粘附分子均可表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組纖粘連蛋白(Fn)和整合素-β1(integrin-β1)mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，整合素-α5的表達(dá)也有所增加；微重力三維培養(yǎng)組E-cadherin的表達(dá)比對(duì)照組細(xì)

5、胞增加了8.15％，差異極顯著(P＜0.01)。 通過RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測了WB-F344細(xì)胞中AFP和ALB的表達(dá)。結(jié)果微重力三維培養(yǎng)細(xì)胞AFPmRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組，而ALBmRNA的表達(dá)低于對(duì)照組；蛋白水平的免疫細(xì)胞化學(xué)AFP陽性細(xì)胞顯著高于平面對(duì)照組且染色較深，平均陽性率比對(duì)照組高20.6％，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.05)，相反，ALB表達(dá)的平均陽性率實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組低27.9％，差異極顯著(P＞0.0

6、1)。說明微重力三維培養(yǎng)條件下，能較好的維持肝干細(xì)胞特性。 為了研究細(xì)胞體外分化潛能，用RT-PCR檢測了OSM誘導(dǎo)7d后WB-F344細(xì)胞中ALB，AFP，desmin，TO，SMA，GGT基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，WB-F344細(xì)胞誘導(dǎo)前表達(dá)AFP和ALB，誘導(dǎo)后表達(dá)ALB而不表達(dá)AFP，說明細(xì)胞已經(jīng)開始分化；用OSM誘導(dǎo)細(xì)胞后，肝干細(xì)胞標(biāo)記AFP消失，肝臟上皮實(shí)質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記ALB、膽管細(xì)胞標(biāo)記GGT和TO均表達(dá)，同時(shí)還表達(dá)SM

7、A，說明微重力條件下培養(yǎng)的細(xì)胞至少也具有雙向分化潛能。 將細(xì)胞通過尾靜脈移植到藥物損傷免疫缺陷鼠3周后，取鼠肝臟及腎臟組織做冰凍切片，然后用特異的兔抗大鼠CK7抗體做免疫組織化學(xué)檢測。結(jié)果在其肝臟內(nèi)檢測到了微重力三維培養(yǎng)的陽性CK7移植細(xì)胞，并形成實(shí)質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，說明WB-F344在體內(nèi)也具有多向分化潛能。 總之，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們建立的WB-F344大鼠肝干微重力三維培養(yǎng)體系是一種良好的細(xì)胞培養(yǎng)模型，為組織工程及空間干