益氣解毒法對大鼠干細(xì)胞系WB-F344作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 研究具有益氣解毒功效的牛黃參(牛黃、西洋參)含藥血清對大鼠肝干細(xì)胞系WB-F344的增殖、凋亡及分化過程中相關(guān)細(xì)胞因子及受體表達(dá)的影響,探討益氣解毒法對肝干細(xì)胞的作用機(jī)制,以便從分子生物學(xué)水平來闡釋益氣解毒法治療慢性肝病的作用原理,為進(jìn)一步研究治則治法提供新的思路,也為臨床推廣應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.含藥血清的制備:體外培育牛黃、西洋參配伍組采用傳統(tǒng)水煎法灌胃動物制作含藥血

2、清(簡稱水煎組);依據(jù)現(xiàn)代藥理藥效研究,提取西洋參中具有抗疲勞作用的西洋參皂甙,總皂甙類成分,提取體外培育牛黃中具有保護(hù)肝細(xì)胞、恢復(fù)肝功能、利膽退黃作用的膽紅素、膽酸、去氧膽酸、牛磺酸類成分制成牛黃參膠囊,后膠囊取粉稀釋使用灌胃動物制作含藥血清(簡稱成分組)。水煎組和成分組在實(shí)驗(yàn)中互為對照組。將大鼠分為空白組、水煎組、成分組,每組各16只。各組給相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃7天(1次/d),給藥濃度為:含牛黃生藥濃度3.6g/L,含西洋參生藥濃度

3、21.6g/L,大鼠按體重100g灌胃1mL的量給藥,空白組灌胃等量的生理鹽水,連續(xù)一周。末次給藥后2h進(jìn)行大鼠頸動脈取血,將采集的血液在室溫中靜置4h,3000rpm,離心15min,收集血清,將收集的血清在56℃水浴30min進(jìn)行滅活,而后在超凈臺內(nèi)用注射濾器(0.22μm微孔濾膜)過濾除菌,分裝成小瓶于-20℃保存?zhèn)溆?需要時用培養(yǎng)液配制成所需濃度的含藥血清。
　　 2.WB-F344細(xì)胞的培養(yǎng):用50mL的培養(yǎng)瓶,將WB

4、-F344接種于含10％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100u/mL青霉素及鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中,細(xì)胞濃度為2×104個/mL,置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞換液時間為2-3天,3-5天傳代,0.25%胰蛋白酶消化后1:2傳代。
　　 3.益氣解毒法對WB-F344增殖的影響:取對數(shù)生長期細(xì)胞用胰酶消化,調(diào)密度為1×105/mL,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后,分別加入濃度為

5、5%、10%、20%的成分組與水煎組藥物血清,空白對照組加入相同濃度梯度的正常大鼠血清,正常對照組則加入等量的培養(yǎng)液,正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組血清作用24h后,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定細(xì)胞的增殖狀況,選取增殖的最佳藥物血清濃度,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以此濃度進(jìn)行研究。
　　 4.益氣解毒法對WB-F344 HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1-R和TGF-β2R表達(dá)的影響:血清分為正常對照組(10%胎牛血清)、空白對照組(10

6、%正常大鼠血清)、成分組(10%成分劑血清)、水煎組(10%水煎劑血清),各組血清作用細(xì)胞24h后,裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞的總蛋白,蛋白印跡法(Western-blot)測定各組WB-F344細(xì)胞的HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R和TGF-β2R的表達(dá)情況。
　　 5.益氣解毒法對WB-F344 AFPmRNA、ALBmRNA表達(dá)的影響:取對數(shù)生長期細(xì)胞,調(diào)密度為5×103/mL,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,8h后換分化培養(yǎng)體

7、系(高糖DMEM、10%胎牛血清、HGF50ng/mL、EGF20ng/mL、胰島素1μg/mL、地塞米松1μmol/L),加入10%成分組和水煎組的含藥血清,并設(shè)立正常和空白血清對照孔,前者加入正常培養(yǎng)液,后者加入10%正常大鼠血清。于0,7、10、14、21d分別收集分化培養(yǎng)細(xì)胞,抽提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)檢測肝干細(xì)胞標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)及肝細(xì)胞標(biāo)志物白蛋白(ALB)的mRNA表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)過程中注意觀察

8、含藥血清刺激后細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　 6.益氣解毒法對WB-F344凋亡的影響:調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL,置于培養(yǎng)板,37℃、6小時靜置,待細(xì)胞貼壁后加入濃度為40ng/mL的轉(zhuǎn)化因子β,再分別加入各組血清干預(yù),血清仍分為正常對照組(10%胎牛血清)、空白對照組(10%正常大鼠血清)、成分組(10%成分劑血清)、水煎組(10%水煎劑血清),待作用細(xì)胞24h后,Annexinv-FITc和PI染色,流式細(xì)胞儀測定并分析數(shù)據(jù)。

9、
　　 結(jié)果：
　　 1.益氣解毒法對WB-F344增殖的影響:10%、20%濃度的牛黃參含藥血清成分組和水煎組均能促進(jìn)WB-F344細(xì)胞的增殖,與空白、正常對照組比較OD值顯著升高(P＜0.01);且10%為細(xì)胞增殖的最佳濃度梯度;各組合藥血清均未表現(xiàn)出對細(xì)胞的毒性作用,鏡下觀察各組細(xì)胞生長良好。
　　 2.益氣解毒法對WB-F344 HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R和TGF-β2R表達(dá)的影響:經(jīng)10

10、%牛黃參含藥血清成分組和水煎組干預(yù)后,WB-F344細(xì)胞HGFR、EGF、ECFR、TGF-β1R和TGF-β2R的表達(dá)量較空白、正常對照組明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且部分指標(biāo)成分組優(yōu)于水煎組(P＜0.05)。
　　 3.益氣解毒法對WB-F344 AFPmRNA、ALBmRNA表達(dá)的影響:經(jīng)10%牛黃參含藥血清成分組和水煎組干預(yù)后,WB-F344肝干細(xì)胞表面標(biāo)志物AFPmRNA的表達(dá)量在細(xì)胞分化過程中隨著時間的延

11、長逐漸減少,肝細(xì)胞表面標(biāo)志物ALB mRNA的表達(dá)量則逐漸增多(P＜0.01);且成分組優(yōu)于水煎組(P＜0.05)。
　　 4.益氣解毒法對WB-F344凋亡的影響:經(jīng)10%牛黃參含藥血清成分組和水煎組干預(yù)后,WB-F344細(xì)胞的凋亡率與空白、正常對照組相比顯著下降(P＜0.01),且成分組優(yōu)于水煎組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.益氣解毒法可以促進(jìn)肝干細(xì)胞WB-F344的增殖,對細(xì)胞未表現(xiàn)出明,顯的

12、毒性作用。
　　 2.益氣解毒法可以促進(jìn)肝干細(xì)胞WB-F344細(xì)胞因子HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R和TGF-β2R的表達(dá)量上調(diào)。
　　 3.益氣解毒法可以通過細(xì)胞因子體系誘導(dǎo)肝干細(xì)胞WB-F344向肝細(xì)胞特異性方向的分化。
　　 4.益氣解毒法具有拮抗肝干細(xì)胞WB-F344凋亡的作用。
　　 5.益氣解毒法所選中藥復(fù)方隨劑型的不同,療效亦有一定的差異,本實(shí)驗(yàn)中成分劑牛黃參膠囊較牛黃參水煎劑效