黃爬表皮毛相關(guān)基因的定位、同源克隆與功能研究.pdf

1、果實刺瘤是黃瓜（Cucumis sativus L.）重要的外觀品質(zhì)之一。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)黃瓜表皮毛和果刺均為多細(xì)胞非腺體的柱狀結(jié)構(gòu)。黃瓜無毛突變體glabrous(l)(gl1)的莖、葉、卷須、花萼、子房均沒有表皮毛，果實表面也沒有果刺和果瘤，是研究黃瓜表皮毛及果實刺瘤形成機(jī)理的理想材料。遺傳分析結(jié)果表明無毛基因(gl1)對控制果瘤性狀的果瘤基因(Tu)存在隱性上位作用。因此，研究黃瓜表皮毛形成的分子機(jī)制有助于探明黃瓜果實刺瘤的形成機(jī)制

2、。另外，表皮毛和果刺是由表皮細(xì)胞分化而來，而表皮細(xì)胞是研究植物細(xì)胞分化最好的模型，因此，對黃瓜表皮毛的形成機(jī)制的研究有助于豐富植物細(xì)胞分化理論。
　　 本研究用歐洲溫室型黃瓜“壯瓜”與無毛突變體gl1雜交構(gòu)建了F2群體，利用無毛表型的F2單株為定位群體，進(jìn)行圖位克隆以分離出無毛基因。同時，還利用生物信息學(xué)的方法分析了黃瓜中的R2R3MYB，bHLH，WD40-repeat和R3 single repeat MYB基因家族的所有成

3、員，并利用同源進(jìn)化分析找出黃瓜中可能和表皮毛形成相關(guān)的同源基因。為了研究這些同源基因的功能，還進(jìn)行了擬南芥和黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果如下:
　　 1.共篩選了322對SSR標(biāo)記，找到了在無毛突變體和壯瓜之間具有多態(tài)的SSR標(biāo)記21個，并將無毛基因gl1定位在3號染色體上的SSR21054和SSR117之間。這兩個標(biāo)記之間的物理距離為3000Kb。根據(jù)無毛突變體的基因組重測序信息，在初步定位區(qū)間內(nèi)找到了在雙親之間有多態(tài)的2個STS

4、標(biāo)記和3個CAPS標(biāo)記。通過對2400棵無毛表型的F2單株進(jìn)行標(biāo)記分析，將gl1基因定位在STS-1和CAPS-1之間，物理距離約311K(28801842-29113539)的區(qū)間內(nèi)，共有52個候選基因。通過對候選基因的注釋及與擬南芥同源基因的比較分析發(fā)現(xiàn)，這52個基因中沒有與細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期或表皮細(xì)胞命運(yùn)決定相關(guān)的同源基因。所以，黃瓜表皮細(xì)胞的分化機(jī)制很有可能與擬南芥有不同之處。
　　 2.通過數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)對無

5、毛突變體及其親本的葉片進(jìn)行了差異表達(dá)基因分析。與親本相比，在無毛突變體葉片中表達(dá)量下調(diào)的基因365個，上調(diào)的基因139個。其中差異倍數(shù)在20倍以上的基因共57個。GO功能富集分析表明，這些差異表達(dá)基因主要參與代謝作用、細(xì)胞過程、刺激應(yīng)答、及細(xì)胞機(jī)構(gòu)合成等相關(guān)生物學(xué)過程。
　　 3.在黃瓜全基因組中，利用BlastP的方法分析了R2R3MYB，bHLH，WD40-repeat和R3 single repeat MYB基因家族，分別

6、找到了46個R2R3MYB基因，138個bHLH基因，191個WD40-repeat基因及1個R3 single repeat MYB基因。利用同源進(jìn)化分析找到了擬南芥中TTG1，MYC1和TRY的同源基因，分別命名為CsTTG1，CsMYC1和CsTRY。另外，黃瓜的R2R3MYB基因家族中沒有與表皮細(xì)胞命運(yùn)決定相關(guān)的基因，但找到了一個與擬南芥GL1同源性最高的R2R3MYB基因，命名為CsGL1-like(CsGL(1)L)。序列分

7、析表明，CsGL1L，CsMYC1， Cs TTG1及CsTRY的CDS長度分別為783bp，1956，1002和249bp，分別編碼260，651，333和82個氨基酸。
　　 4.為了分析CsGL1L，CsMYC1， CsTTG1及CsTRY的亞細(xì)胞定位情況，分別構(gòu)建了CsGL1L，CsMYC1， CsTTG1及CsTRY與GFP的融合蛋白。共聚焦結(jié)果顯示CsGL1L，CsMYC1， CsTTG1及CsTRY均定位在洋蔥表皮

8、的細(xì)胞核中。
　　 5.組織特異性分析結(jié)果表明，CsGL1L, CsMYC1， CsTTG1及CsTRY在黃瓜的各組織中均有不同程度的表達(dá)。其中CsGL1L主要在果實中表達(dá)，CsMYC1在根、莖、葉、花和果實中表達(dá)量均較高，只在卷須中表達(dá)量較低。CsTTG1在各個組織器官中表達(dá)量均較高。CsTRY主要在葉片，根和卷須中表達(dá)量高，在莖、雄花和果實中表達(dá)量較低。
　　 6.為了分析CsGL1L，CsMYC1，Cs TTG1及

9、CsTRY的功能，分別構(gòu)建了這四個基因的過表達(dá)及RNAi載體。擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化實驗表明，在擬南芥gl1突變體中過表達(dá)CsGL1L沒有恢復(fù)gl1突變體有毛的表型。在野生型擬南芥Co(l)中分別過表達(dá)CsGL1L和CsMYC1可以使轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉上的表皮毛數(shù)量顯著增加，但過表達(dá)CsTTG1后，轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉上的表皮毛數(shù)量與野生型相比沒有明顯的變化。
　　 7.為了進(jìn)一步分析CsGL1L，CsMYC1， CsTTG1及CsTRY在