血管緊張素Ⅱ加速CKDApoE---小鼠動脈粥樣硬化及其早、晚期炎癥機制.pdf

1、背景和目的:動脈粥樣硬化（Atherosclerosis, As）是慢性腎臟?。–hronic kidney disease, CKD）患者高發(fā)的心血管疾?。–ardiolvascular disease, CVD）。CKD可以加速 As的形成。既往的研究結(jié)果和文獻報道，血管緊張素II（Angiotensin II, Ang II）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide ph

2、osphate oxidases, NOXs）均與CKD和As緊密相關(guān)。然而，仍然鮮有報道關(guān)注CKD加速As形成過程中，早期炎癥階段Ang II和NOXs在其中的相互作用和表現(xiàn)情況。運用Ang II1型受體拮抗劑——氯沙坦，可以在動物模型中觀察Ang II在整個As形成過程中的作用。本研究期望了解各個炎癥細胞和炎癥相關(guān)因子和蛋白在As形成過程中水平的變化，探討Ang II促血管內(nèi)皮細胞炎癥反應NOXs的表達時間依賴性和通路機制。

3、　　方法:
　　1.體內(nèi)實驗
　?。?）用5/6腎切除法（5/6Nephrectomy,5/6Nx）構(gòu)建ApoE-/-小鼠CKD+As模型。
　?。?）將ApoE-/-小鼠分為3組，分別為假手術(shù)的對照組、5/6Nx組、5/6Nx+losartan組，建模手術(shù)結(jié)束2w后開始予以5/6Nx+氯沙坦組小鼠15mg/kg/d劑量的氯沙坦灌胃，其余小鼠給予等體積的1%羧甲基纖維素鈉溶液。
　?。?）建模前、建模成功后、As

4、早期和As晚期分別取小鼠尾靜脈血測Scr、BUN、Ang II、中性粒細胞和單核細胞比例、VCAM-1、CINC-1、MCP-1在外周血中的水平。
　?。?）連續(xù)灌胃4w后，隨機抽取各小組小鼠一半的數(shù)量摘取小鼠心臟標本，制作主動脈根部主動脈瓣切片，胸主動脈和腹主動脈留取用于實時熒光定量PCR和Western Blot檢測；剩余小鼠在繼續(xù)灌胃給藥16w后同上方法留取標本待測。
　?。?）用HE染色法觀測小鼠主動脈根部As斑塊形

5、成的情況，IHC法觀測主動脈根部中性粒細胞、巨噬細胞浸潤情況，Ly6G標記中性粒細胞、CD68標記巨噬細胞，NOX1、NOX2、NOX4抗體標記觀測主動脈根部主動脈管壁三種 NOXs蛋白的表達情況，主動脈根部的各項指標統(tǒng)計用Image Pro Plus6.0進行陽性指標面積的統(tǒng)計，計算陽性指標面積占血管壁橫截面積的比例，再用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　?。?）用PCR和WB方法檢測小鼠胸腹主動脈NOX1、NOX2和NOX

6、4的mRNA和蛋白表達情況，并用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　2.體外實驗
　　（1）用CCK-8法檢測適用于Ang II干預HUVECs實驗的濃度。
　?。?）Ang II干預HUVECs10、20、30、40、50、60min和1、2、4、8、12、24h，運用DHE和DCFH-DA熒光探針檢測細胞ROS的合成情況，運用實時熒光定量PCR和Western Blot方法檢測NOX1、NOX2、NOX4的mR

7、NA和蛋白表達情況以及p-p38、p-ERK1/2、p-JNK的蛋白表達情況，干預HUVECs后留取的培養(yǎng)基上清液用ELISA檢測試劑盒檢測上清液中IL-8、MCP-1、TNF-α、IL-6的水平。
　　（3）運用apocynin輔助探究Ang II刺激HUVECs后各NOXs蛋白和MAPK通路的表達。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實驗結(jié)果
　　1.1 血清生化分析
　　5/6Nx的ApoE-/-小鼠外周血Sc

8、r、BUN、Ang II水平穩(wěn)定升高（P＜0.05），氯沙坦可降低5/6Nx組Ang II水平（P＜0.01）。
　　1.2 PBMCs免疫細胞和趨化因子水平
　?。?）5/6Nx組外周血中性粒細胞比例和趨化因子CINC-1均在As早期時呈一過性升高（P＜0.001），在As晚期下降，5/6Nx組水平低于對照組和5/6Nx+氯沙坦組（P＜0.05）。
　　（2）外周血單核細胞比例和趨化因子MCP-1在整個As形成過程呈

9、逐漸升高，晚期As達到最高（P＜0.05）。
　　1.3 小鼠主動脈取材檢測結(jié)果
　?。?）HE染色結(jié)果可見5/6Nx組As斑塊較對照組As斑塊面積比例高，氯沙坦的持續(xù)干預可以部分抑制5/6Nx導致的斑塊形成速度和面積比例，但仍高于對照組。
　?。?）As早期5/6Nx組的NOX1、NOX2和NOX4的表達高于對照組，氯沙坦給藥4w可以部分抑制NOX1和NOX2的激活，但不能有效控制主動脈中的NOX4表達水平（P＜0.

10、05）。
　?。?）As晚期5/6Nx組的NOX1和NOX2的表達仍較對照組高（P＜0.05），但予以氯沙坦持續(xù)干預16w仍能部分控制NOX1的表達，但不能有效控制NOX2的表達，As晚期三組小鼠主動脈NOX4的表達無明顯差異（P＜0.05）。
　　2.體外實驗結(jié)果
　　2.1 Ang II干預HUVECs早、晚期NOXs、ROS、MAPK的表達情況
　?。?）Ang II干預HUVECs10、20、30、40、

11、50、60min后，NOX1和NOX2的mRNA和蛋白表達在30和40min處達到最大合成量，NOX4的mRNA和蛋白表達在20和30min處達到最大合成量（P＜0.05）。Ang II干預HUVECs1、2、4、8、12、24h后，NOX1和NOX2的mRNA和蛋白表達在8h處達到最大合成量，NOX4的mRNA和蛋白表達在4h處達到最大合成量（P＜0.05）。
　?。?）Ang II干預HUVECs10、20、30、40、50、

12、60min后，O2·-的合成在30和40min處最高（P＜0.05），H2O2的合成在20和30min處最高（P＜0.05），作用HUVECs1、2、4、8、12、24h后O2·-和H2O2的合成組間無明顯統(tǒng)計學差異。
　?。?）Ang II干預HUVECs10、20、30、40、50、60min后p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達最高時間段分別在30-40min、30min、20-30min。Ang II作用HUV

13、ECs1、2、4、8、12、24h后MAPK的三條通路的p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達最高時間點分別在8h、8h、4h處（P＜0.05）。
　?。?）Ang II干預HUVECs，4h時細胞因子IL-8、MCP-1、TNF-α、IL-6合成分泌均達到最高水平(P＜0.001)。
　?。?）預處理apocynin后Ang II干預HUVECs，發(fā)現(xiàn)H2O2由NOX4經(jīng)JNK通路激活合成，O2·-主要由NOX1

14、和NOX2經(jīng)p38和ERK1/2通路激活合成。
　　結(jié)論:
　　1.5/6Nx加速ApoE-/-小鼠的主動脈根部As斑塊形成，氯沙坦的持續(xù)干預可部分抑制斑塊形成速度和面積比例。
　　2.在As早期，氯沙坦可有效降低部分Ang II、VCAM-1、CINC-1、中性粒細胞比例水平和主動脈NOX1、NOX2的表達水平。
　　3.在As晚期，Ang II并非主導As形成和持續(xù)加重的最主要因素。
　　4.Ang I