MIP-T3在慢性阻塞性肺疾病患者呼吸道上皮的表達(dá)研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種具有氣流受限特征的疾病,氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展,與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常反應(yīng)有關(guān)。COPD是一種全身性疾病,它嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量,也給其家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但COPD發(fā)病機(jī)制還未完全明了。研究證實(shí)COPD患者存在氣道上皮纖毛結(jié)構(gòu)和功能的異常,纖毛的異常會(huì)導(dǎo)致粘液纖毛清除功能(muco

2、ciliary clearance,MCC)的下降,導(dǎo)致分泌物潴留,小氣道阻塞,局部防御系統(tǒng)破壞,引起反復(fù)感染,是病情反復(fù)及逐漸加重的關(guān)鍵因素之一。纖毛結(jié)構(gòu)和功能的異常在COPD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,目前對(duì)COPD纖毛結(jié)構(gòu)和功能異常的機(jī)制特別其分子機(jī)制仍然不清楚,對(duì)該機(jī)制進(jìn)行研究有利于COPD防治。
　　 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3結(jié)合蛋白1(Tumor necrosis factor receptorassociated f

3、actor3(TRAF3)-interacting protein1,TRAF3IP1 or MIP-T3)是一種纖毛蛋白,可能參與胞質(zhì)中合成的纖毛蛋白運(yùn)送到纖毛內(nèi)組裝的過(guò)程。MIP-T3也是一種微管結(jié)合蛋白,分子量83KD,是腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)的結(jié)合蛋白,其與TRAF3同時(shí)表達(dá)時(shí)才能結(jié)合到微管上。另外還發(fā)現(xiàn)MIP-T3與IL-13受體α1亞單位結(jié)合,抑制IL-4/IL-13下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)STAT6的磷酸化。在模式

4、生物如衣藻、秀麗隱桿線蟲、斑馬魚、果蠅、小鼠中發(fā)現(xiàn)它同纖毛的形成和功能密切相關(guān),在MIP-T3突變、缺陷和敲除模型中發(fā)現(xiàn)纖毛出現(xiàn)不同程度的改變,如纖毛稀疏、短小、微管結(jié)構(gòu)缺陷或紊亂。人體觀察發(fā)現(xiàn)MIP-T3在人體很多組織中,比如在支氣管、肺、睪丸、卵巢、脊髓、甲狀腺、前列腺等存在纖毛的組織都有表達(dá),特別是在纖毛結(jié)構(gòu)豐富的睪丸組織中表達(dá)量較高。由于MIP-T3在進(jìn)化上存在高度的保守性,鑒于其在模式生物纖毛形成過(guò)程中的重要作用,我們推測(cè)其在

5、人的纖毛形成過(guò)程中也起到重要作用。目前對(duì)其研究多集中在模式生物及細(xì)胞株,但尚未發(fā)現(xiàn)其與人類疾病尤其是呼吸道纖毛疾病的關(guān)系。Foxil、Rfx3是纖毛形成的標(biāo)志基因,在纖毛的形成過(guò)程中是關(guān)鍵調(diào)控作用的核因子,我們對(duì)照其觀察MIP-T3的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)初步探討MIP-T3在COPD纖毛異常中的作用及與臨床指標(biāo)和肺功能的關(guān)系,加深對(duì)COPD及纖毛功能的認(rèn)識(shí),同時(shí)對(duì)纖毛功能障礙在該疾病中造成的影響引起重視,為尋找COPD的其他治療方法提供理論基礎(chǔ)

6、。
　　 目的：通過(guò)比較COPD組、吸煙組和對(duì)照組間MIP-T3的表達(dá)和段以上支氣管纖毛超微結(jié)構(gòu)的差異,探討MIP-T3在COPD纖毛異常所起的作用。
　　 方法：研究對(duì)象分為3組,COPD組、吸煙組及對(duì)照組。入選病例均來(lái)源于2010年2月至2010年11月在廣東省人民醫(yī)院肺科或胸外科行肺葉切除術(shù)的患者。COPD組為吸煙指數(shù)≥10包/年,已確診有COPD者,n=18,其中男17例,女1例,年齡49—75歲,平均62.2±

7、9.4歲,其中腺癌14例,鱗癌3例,肺結(jié)核1例。診斷按照慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)標(biāo)準(zhǔn)。吸煙組為吸煙指數(shù)≥10包/年,肺功能正常者,n=17,其中男16例,女1例,年齡41—74歲,平均57.4±10.4歲,其中腺癌15例,鱗癌1例,肺結(jié)核1例。對(duì)照組為無(wú)吸煙史,肺功能正常者,n=21,其中男18例,女3例,年齡41—76歲,平均58.6±11.2歲,腺癌18例,肺結(jié)核2例,鱗癌1例。各組的性別、年齡及疾病構(gòu)成比無(wú)統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)差異,COPD組和吸煙組的吸煙量無(wú)顯著性差異,資料具有可比性。收集遠(yuǎn)離肺腫物5cm以上的段以上支氣管和末端肺組織,將支氣管和末端肺組織分離后迅速投入液氮,另取一份支氣管組織投入電鏡固定液行預(yù)固定。制備透射電鏡標(biāo)本,觀察纖毛的超微結(jié)構(gòu),計(jì)算纖毛軸絲超微結(jié)構(gòu)異常(Axonemal ultrastructure abnormality,AUA),其包括纖毛膜水皰、中央微管移位或數(shù)量變化、外周微管移位及數(shù)量變化、復(fù)合纖毛及巨大纖毛五種類型,并

9、計(jì)算各分類的異常百分率。液氮研磨組織,利用Trizol法提取總RNA并測(cè)定RNA濃度,余實(shí)驗(yàn)按TAKARA公司提供的逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法測(cè)定COPD組、吸煙組和對(duì)照組的支氣管組織和肺組織的MIP-T3、Foxj1、Rfx3 mRNA的表達(dá),計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量:2-ΔCT(ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因)。
　　 結(jié)果：
　　 1.纖毛異常百分率的比較情況及與臨床

10、指標(biāo)的相關(guān)性分析
　　 1.1 纖毛軸絲超微結(jié)構(gòu)異常 COPD組、吸煙組和對(duì)照組的纖毛軸絲超微結(jié)構(gòu)異常百分率分別為(12.74±3.17)％vs(4.61±1.90)％vs(4.24±1.07)％,P<0.001。COPD組分別高于其余2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),但對(duì)照組和吸煙組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 1.2 纖毛膜水皰 COPD組、吸煙組和對(duì)照組的纖毛膜水皰百分率分別為(1.38±0.82

11、)％vs(0.19±0.12)％vs(0.15±0.13)％,P=0.002。COPD組分別高于其余2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),但對(duì)照組和吸煙組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 1.3 中央微管缺陷 COPD組、吸煙組和對(duì)照組的纖毛膜水皰百分率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.19±0.26)％vs(0.03±0.06)％vs(0.01±0.03)％,P>0.05。
　　 1.4 巨大纖毛 COPD組、吸煙組和

12、對(duì)照組的纖毛膜水皰百分率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.22±1.40)％vs(0.26±0.37)％vs(0.16±0.26)％,P>0.05。
　　 1.5 外周微管缺陷 COPD組、吸煙組和對(duì)照組的外周微管缺陷百分率分別為(5.20±1.52)％vs(3.08±1.09)％vs(1.86±0.89)％,P<0.001。COPD組高于其余2組(均P<0.01),吸煙組高于對(duì)照組(P<0.01)。
　　 1.6 復(fù)合纖毛 CO

13、PD組、吸煙組和對(duì)照組的復(fù)合纖毛缺陷百分率分別為(4.75±2.12)％vs(1.04±1.01)％vs(2.05±0.9)％,P=0.001。COPD組高于吸煙組和對(duì)照組(分別為P<0.05和P<0.01),對(duì)照組高于吸煙組(P<0.05)。
　　 1.7 相關(guān)分析 COPD組中,纖毛軸絲超微結(jié)構(gòu)與FEV1成負(fù)相關(guān)(r=-0.766,P<0.05),與FEV1％pred成負(fù)相關(guān)(r=-0.777,P<0.05),與FEV1/F

14、VC成負(fù)相關(guān)(r=-0.684,P<0.05)。
　　 2.支氣管組織中各組的MIP-T3、Foxj1、Rfx3 mRNA表達(dá)結(jié)果比較
　　 2.1 MIP-T3:COPD組、吸煙組和對(duì)照組的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[0.021(0.013～0.034)]vs[0.043(0.033～0.053)]vs[0.034(0.019～0.052)],P=0.001,COPD組的表達(dá)量較對(duì)照組和吸煙組低(分別為P<0.05,P<0

15、.01)。
　　 2.2 Foxil:COPD組、吸煙組和對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[0.014(0.006～0.028)]vs[0.027(0.014～0.063)]vs[0.018(0.012～0.032)],P>0.05。
　　 2.3 Rfx3:COPD組、吸煙組和對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[0.025(0.007～0.044)]vs[0.021(0.013～0.048)]vs[0.019(0.008～0.058)],P

16、>0.05。
　　 2.4 相關(guān)分析:COPD組中,MIP—T3與Foxj1、Rfx3的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？傮w相關(guān):MIP-T3與Foxj1成正相關(guān)(r=0.520,P<0.01),MIP-T3與Rfx3的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3.肺組織中各組的MIP-T3、Foxj1、Rfx3 mRNA表達(dá)結(jié)果比較
　　 3.1 MIP-T3:COPD組、吸煙組和對(duì)照組的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)

17、學(xué)意義[0.035(0.020～0.045)]vs[0.030(0.022～0.038)]vs[0.028(0.025～0.042)],P>0.05。
　　 3.2 Foxil:COPD組、吸煙組和對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[0.007(0.004～0.010)]vs[0.008(0.005～0.015)]vs[0.007(0.005～0.012)],P>0.05。
　　 3.3 Rfx3:COPD組、吸煙組和對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)

18、計(jì)學(xué)差異[0.009(0.006～0.017)]vs[0.008(0.005～0.014)]vs[0.012(0.007～0.021)],P>0～5。
　　 3.4 肺組織中MIP-T3與Foxj1、Rfx3的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.COPD病人MIP-T3的表達(dá)與纖毛異常百分率及臨床資料的相關(guān)分析
　　 4.1 MIP-T3的表達(dá)量與纖毛異常的相關(guān)性纖毛軸絲超微結(jié)構(gòu)異常與MIP-T3無(wú)顯著相關(guān)性。但在異

19、常纖毛的各種類型中:支氣管MIP-T3的表達(dá)量與外周微管缺陷異常百分率存在負(fù)相關(guān)(r=-0.750,P<0.05),與其余異常類型不存在相關(guān)性。
　　 4.2 MIP-T3與臨床資料的相關(guān)性 MIP-T3與吸煙指數(shù)、FVC、FEV1、FEV1％Pred、FEV1/FVC的相關(guān)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.COPD病人存在纖毛結(jié)構(gòu)的異常,主要表現(xiàn)為纖毛膜水皰增多、外周微管缺陷增加及復(fù)合纖毛增多,且病情