短期高鹽攝入誘導的Th17-Treg細胞免疫失衡與靶器官炎癥反應的關系.pdf

1、研究目的:高鹽(high salt，HS)飲食不僅是高血壓的致病因素，還能獨立于血壓水平造成靶器官損傷。越來越多的證據(jù)顯示免疫系統(tǒng)在高血壓及其靶器官損傷發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其中機體獲得性免疫機制是引發(fā)靶器官炎癥反應的關鍵因素之一。近來研究顯示，輔助性T細胞17(T helper cell17，Th17)（生成白介素-17）和調節(jié)性T細胞(RegulatoryT cell，Treg)(表達轉錄因子FoxP3)各自發(fā)揮促炎和抗炎效應。Th1

2、7/Treg免疫平衡的調控是目前研究的熱點。由Th17/Treg免疫失衡所致炎癥紊亂，即免疫-炎癥軸失衡參與了靶器官炎癥反應和損傷。高鹽攝入是否可通過影響人類Th17/Treg平衡進而引起靶器官的炎癥反應尚未見報道。本研究旨在對健康志愿者中通過慢性鹽負荷試驗，觀察在此期間外周血Th17/Treg免疫平衡的動態(tài)變化，并探討其可能機制，以及與靶器官炎癥反應的關系。
　　研究內容與方法:共納入健康男性志愿者15人。平均26.93±0.9

3、2歲。
　　(1)按照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）每日低于5g食鹽（即NaCl）的攝入量作為低鹽飲食標準。高鹽飲食的標準確定為15g/日。由研究者按以上食鹽攝入標準，給所有志愿者統(tǒng)一提供飲食并在同一地點就餐。整個飲食干預時間共17天，分為基線期（第1-3天，志愿者依據(jù)個人口味在同一地點自由進餐，共3天），隨后緊接高鹽期（第4-10天，共7天），最后進入低鹽期（第11-17天，共7天）。

4、
　　(2)每天測量并記錄收縮壓、舒張壓和心率。于基線期第3天(day3，D3)，高鹽第7天(day10，D10)，低鹽期第7天(day17，D17)收集24小時尿，進行常規(guī)生化等檢驗。
　　分別在基線第3天(day3，D3)，高鹽飲食第1天(day4，D4)、高鹽飲食第2天(day5，D5)、高鹽飲食第7天(day10，D10)、低鹽飲食第7天(day17，D17)采集受試者外周血進行免疫細胞流式細胞術（flow cyto

5、metry，F(xiàn)CM）檢測，對CD4+和CD8+淋巴細胞亞群、B細胞(CD19)，以及Th17和Treg細胞表面分子抗體（CD4、CD25、IL-17和FoxP3）進行四色流式分析。對基線第3天(day3，D3)和高鹽第2天(day4，D4)采集外周血使用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，通過基因芯片技術對其進行表達譜分析。使用TRIzol試劑裂解單個核細胞后，提取總RNA;采用聚合酶鏈反應(PCR)對表達譜分析確定的感興趣差異基因進行

6、mRNA水平的驗證。
　　分別于基線第3天(day3，D3)，高鹽飲食第1天(day4，D4)、高鹽飲食第7天(day10，D10)、低鹽飲食第1天(day11，D11)，低鹽飲食第7天(day17，D17)采用飛利浦Intera3.0T全身磁共振系統(tǒng)對受試者腹部橫斷面T2WI掃描及冠狀面高清BOLD-MRI掃描并計算腎髓質的表觀-自旋弛豫率（R2*，R2*值與局部組織氧合水平呈正相關）。
　　分別于基線第3天(day3，D

7、3)，高鹽飲食第1天(day4，D4)、高鹽飲食第7天(day10，D10)、低鹽飲食第7天(day17，D17)通過無創(chuàng)超聲評價肱動脈血流介導性的血管舒張(flow mediated dilation，F(xiàn)MD)。
　　結果:15名志愿者完成全部飲食干預及血液和尿液的有關檢測，并根據(jù)24小時尿量、尿鈉總量、尿肌酐總量以及血鈉水平等指標進行質量控制并判定所得實驗數(shù)據(jù)可靠。
　　(1)尿量、尿電解質和尿肌酐的變化:與基線期相比，

8、高鹽飲食期第7天24小時尿量（2241±615mL vs.1773±918mL）、尿鈉（325.6±43.3mmolvs.152.9±52.1 mmol）、尿鉀（38.9±8.9mmol vs.30.2±9.7mmol）均明顯升高，且均有統(tǒng)計學差異（P均＜0.05）。與高鹽飲食期第7天相比，低鹽飲食期第7天尿量、尿Na+、尿K+顯著降低且均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.001)。高鹽飲食期與基線期和低鹽飲食期相比24小時尿肌酐顯著升高（P均＜

9、0.001）。
　　(2)血壓、心率的變化:與基線期相比，高鹽期收縮壓和舒張壓有上升趨勢，低鹽期呈現(xiàn)下降趨勢，但變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而心率在高鹽飲食期明顯增快(P＜0.01)，心率在低鹽期較高鹽期減慢(P＜0.05)。
　　(3)流式分析結果:CD3+、CD4+T細胞亞群及B淋巴細胞(CD19)均無明顯變化(P＞0.05)。食鹽攝入變化可導致Th17/Treg細胞比例發(fā)生變化，高鹽第2天Th17細胞數(shù)量較基線水

10、平下降(P＜0.05)，而Treg細胞數(shù)量較基線水平升高(P＜0.05)。而隨著高鹽攝入的持續(xù)，Th17細胞數(shù)量增加，而Treg細胞數(shù)量降低，至高鹽第7天Th17/Treg比例較基線與低鹽第7天均明顯升高（P＜0.05）。
　　(4)基因芯片表達譜分析結果顯示:與基線相比，高鹽飲食第2天Th17相關信號通路表達下調(P＜0.01)，而Treg相關信號通路表達上調(P＜0.01)。相關基因SGK-1表達上調。
　　(5)表達譜

11、芯片的PCR驗證，即炎癥因子IL-23和IL-8第一天時表達下降(P＜0.05)，Th17通路因子CD247表達下調(P＜0.05)，隨后相關炎癥因子如NFκB隨高鹽負荷加重表達逐漸升高(P＜0.05)。NFAT5在高鹽第2天表達升高(P＜0.05)，SGK-1也表達升高(P＜0.05)。隨著高鹽負荷加重，炎癥因子表達上調(P＜0.05)，而Treg相關抑制因子表達下降(P＜0.05)。
　　(6)腎髓質氧合水平的變化:腎髓質R2

12、*值在高鹽期同基線期比顯著升高(P＜0.05)，且維持于相對穩(wěn)定水平;增加的腎髓質R2*值在低鹽期逐漸下降至基線水平，低鹽第7天腎髓質R2*值同高鹽期比顯著下降(P＜0.05)。
　　(7)FMD結果表明:高鹽飲食第1天FMD較基線期及高鹽飲食第7天明顯升高(P＜0.05)，至低鹽期恢復至基線期水平，無明顯差異(P＞0.05)。
　　結論:本研究首次證實高鹽飲食能夠引起健康志愿者循環(huán)中Th17/Treg免疫細胞比例和相關基因