利用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)水稻白葉枯病感病相關(guān)基因HW3進(jìn)行定點(diǎn)修飾及功能分析.pdf

1、由黃單胞桿菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzaepv.Oryzae,Xoo)所引起的水稻白葉枯病是全球水稻生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一,能夠引起水稻減產(chǎn)高達(dá)50％。一直以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究重點(diǎn)主要集中于抗病基因，利用寄主的抗性來(lái)控制白葉枯病。已經(jīng)鑒定出了42個(gè)抗病基因（Xa1到xa41（t）），這些抗病基因中有的抗譜較窄，有的抗性較弱，有的是隱性基因。所以，不斷發(fā)掘新的抗病資源對(duì)全世界的水稻生產(chǎn)都具有重要作用。通過(guò)利用抗病基因來(lái)

2、培育抗白葉枯病的品種并非唯一途徑，近年來(lái)研究顯示通過(guò)調(diào)控感病基因也能提高水稻對(duì)白葉枯病的抗性。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)掘了一個(gè)水稻白葉枯病的感病基因 HW3，并利用人工核酸酶 CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)等對(duì)其進(jìn)行了功能鑒定，獲得主要研究結(jié)果如下：
　　1.本實(shí)驗(yàn)室前期用白葉枯病強(qiáng)致病菌株P(guān)XO99A接種一對(duì)抗感近等基因系，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示一個(gè)基因HW3在感病系IR24中高表達(dá)而在其抗病近等基因系5024中幾乎不表達(dá)。

3、本研究對(duì)其進(jìn)行 qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果一致，我們推測(cè)這個(gè)基因可能與感病相關(guān)。
　　2.生物信息學(xué)分析表明HW3基因全長(zhǎng)1771 bp，有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，cDNA全長(zhǎng)1275 bp，編碼一個(gè)含424個(gè)氨基酸的未知蛋白。
　　3.通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)HW3基因在IR24和5024中無(wú)論是外顯子還是內(nèi)含子的序列都是相同的。又通過(guò)擴(kuò)增HW3發(fā)現(xiàn)在翻譯起始密碼子ATG上游252 bp處，IR2

4、4和5024之間有一個(gè)SNP(single nucleotide polymorphism)的差異。
　　4.構(gòu)建了亞細(xì)胞定位表達(dá)載體pC1205-YFP-HW3，通過(guò)煙草表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，并利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)HW3蛋白定位在細(xì)胞核上。
　　5.在 HW3基因的第一個(gè)外顯子上選擇兩個(gè)靶位點(diǎn)，構(gòu)建了 CRISPR/cas9植物表達(dá)載體pC-HW3。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，將pC-HW3轉(zhuǎn)化到IR24品種中

5、，獲得20株T0代轉(zhuǎn)基因植株。
　　6.用PXO99A對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行田間剪葉接種鑒定。接種7天時(shí)觀察，有4個(gè)植株幾乎未發(fā)病;接種15天時(shí)觀察，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的病斑長(zhǎng)度與IR24的病斑長(zhǎng)度存在顯著差異，表明這4株轉(zhuǎn)基因植株對(duì)PXO99A表現(xiàn)抗病。
　　7.對(duì)上述4株轉(zhuǎn)基因抗病株及16株轉(zhuǎn)基因感病株的CRISPR靶位點(diǎn)的突變型進(jìn)行了PCR分子檢測(cè)，通過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)這4株轉(zhuǎn)基因抗病株在 CRISPR靶位點(diǎn)處發(fā)生的都是

6、雙等位突變（Bi-allelic），并且兩個(gè)靶位點(diǎn)處都有突變發(fā)生，而剩余16株轉(zhuǎn)基因感病株在靶位點(diǎn)處并沒(méi)有發(fā)生突變。結(jié)果顯示這4株轉(zhuǎn)基因抗病株的抗病表型與HW3基因的剪切突變相關(guān)，也說(shuō)明HW3是水稻白葉枯病的寄主感病相關(guān)基因。
　　8.對(duì)上述4個(gè)T0代抗病植株的T1代株系進(jìn)一步田間接種鑒定與分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)T1的抗病表型與T0代是一致的。分子檢測(cè)表明T0代出現(xiàn)的所有CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的植株的靶位點(diǎn)突變都能傳遞到T1代。