酵母雙雜交篩選p70S6K相互作用蛋白及RPS5功能初步分析.pdf

1、p70S6K(p70Ribosomal Protein S6Kinase1,p70S6K,S6K1)是Ser/Thr激酶，mTORCl(Mechanistic Target of Rapamycin Complex1)的下游效應(yīng)分子之一，可以使得核糖體蛋白S6(Ribosomal Protein S6，rpS6，S6)磷酸化，促進蛋白質(zhì)合成。細胞內(nèi)外營養(yǎng)及能量環(huán)境的變化會影響p70S6K(S6K1)活性，調(diào)控蛋白質(zhì)合成，從而調(diào)控細胞代謝

2、和生理狀態(tài)。RPS5基因產(chǎn)物RPS5蛋白(40S Ribosomal Protein S5)是真核生物核糖體40S小亞基的一個亞單位，在維持翻譯準確性上發(fā)揮重要作用，可與病毒IRES(Internal Ribosome Entry Site)相互作用，在介導與IRES相關(guān)的翻譯起始中具有重要意義。目前對RPS5功能的了解有限，對其與相關(guān)激酶的相互作用亦未見報道。
　　實驗利用pGBKT7-S6K1載體表達誘餌蛋白，篩選pGADT7

3、-cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)與p70S6K(S6K1)相互作用蛋白并對其編碼基因測序，進而從鑒定得到的基因中挑選功能尚不清楚的RPS5基因產(chǎn)物進行免疫共沉淀驗證。RT-PCR克隆RPS5基因并構(gòu)建過表達載體pIRES2-EGFP-RPS5和靶向RPS5基因RNA干擾載體pRNAT-U6.1/Neo-RPS5-shRNA，轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細胞，MTT法檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞周期。
　　結(jié)果表明:1）含pGBKT7-S6K1質(zhì)粒

4、的Y2H酵母菌和含pGADT7-cDNA質(zhì)粒的Y187酵母菌進行酵母雙雜交后，通過四輪缺陷平板及抗生素篩選，得到27株酵母;2）得到的含有pGADT7-未知蛋白cDNA的27株Y2H酵母分別與pGBKT7-S6K1做一對一轉(zhuǎn)化實驗，確認的陽性克隆送出去測序，序列分析得到Ribosomal Protein S5(RPS5),Musimon Chromosome3Open Reading Frame(C3H12orf75),Ornithin

5、e Decarboxylase Ant Izyme1(OAZl),Secreted Protein,Acidic,Cysteine-Rich(SPARC),Eukaryotic Translation Initiation Factor1-Like Pseudogene(LOC100300942)和ER Membrane Protein Complex Subunit8（EMC8）等6個基因;3）選擇我們認為重要且功能不清楚的RPS5，

6、通過免疫共沉淀再次驗證，表明RPS5與p70S6K(S6K1)具有相互作用關(guān)系。RPS5可能是p70S6K(S6K1)一個新的作用靶;4）RPS5基因ORF全長615bp，編碼204個氨基酸殘基。過表達RPS5基因促進細胞增殖(p＜0.05)和細胞周期進程;5）轉(zhuǎn)錄后沉默RPS5，抑制細胞增殖(p＜0.05)和細胞周期進程。
　　本文利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出S6K1相關(guān)蛋白6個，對其中RPS5功能進行了初步的探究，表明RPS5對G