基于轉(zhuǎn)錄組芯片篩選的新型LncRNA在CAD早期診斷中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、本文內(nèi)容從兩個部分進(jìn)行了論述
　　第一部分
　　研究背景和目的:
　　近來CAD被認(rèn)為是一種慢性炎性疾病，主要累及大-中肌型動脈，以動脈粥樣硬化斑塊形成為特征。已有研究證實在外周血中占粒細(xì)胞總數(shù)約5-10％的單核細(xì)胞在AS形成這一病理過程中發(fā)揮重要作用。本課題將系統(tǒng)地研究CAD病人單核細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的變化，篩選新型CAD相關(guān)的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，建立早期診斷CAD

2、的“l(fā)ncRNA分子診斷模型”，并對該模型的準(zhǔn)確性和有效性進(jìn)行驗證。在此基礎(chǔ)之上，研究其生物學(xué)功能，全面評估其在CAD發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　第一章
　　本研究共入選了502例在本科介入中心接受冠脈造影的CAD及對照患者，病人的相關(guān)臨床資料完整。采用lncRNA表達(dá)譜芯片對15例男性CAD病人和15例男性對照患者單核細(xì)胞和血漿進(jìn)行研究，采用實時定量PCR方法在相同的單核細(xì)胞樣本里驗證了芯片結(jié)果，接著我們又在

3、另一個20×20的人群對篩選的3個lncRNAs進(jìn)行了驗證及ROC曲線分析。我們進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量(211×171)對CoroMarker與CAD之間的關(guān)系進(jìn)行病例對照研究，并隨機(jī)抽樣分為訓(xùn)練樣本161×121和驗證樣本(50×50)，根據(jù)訓(xùn)練樣本構(gòu)建“CoroMarker分子Fisher判別模型”，同時對對照研究人群、訓(xùn)練樣本和驗證樣本分別進(jìn)行ROC曲線分析和危險因素分析。同時，在一個獨立人群(50×40)進(jìn)行前瞻性的診斷研究。最后，在

4、不同心血管疾病中對其特異性檢測。
　　第二章
　　根據(jù)芯片結(jié)果，篩選差異基因并對其進(jìn)行GO、Pathway、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及功能富集分析，同時，在體外應(yīng)用電轉(zhuǎn)的方法，特異性siRNA敲降CoroMarker的表達(dá)，觀察THP-1細(xì)胞增殖及炎性細(xì)胞因子分泌等生物學(xué)行為的變化。
　　結(jié)果:
　　第一章
　　根據(jù)lncRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果，我們成功篩選到51個在CAD病人單核細(xì)胞和血漿中同時高表達(dá)的lncRNAs，進(jìn)

5、一步篩選出其中5個差異顯著高豐度表達(dá)的lncRNAs，在(20×20)人群中，采用qPCR及ROC曲線分析方法分析得到在CAD病人單核細(xì)胞中高表達(dá)的3個lncRNA（CoroMarker，IL21R和BAT5），AUC分別為0.94、0.825和0.818，故確定CoroMarker為研究對象。在接下來的臨床大樣本(211×171)驗證過程中，根據(jù)最優(yōu)抽樣效果構(gòu)建CoroMarker的Fisher判別模型，F(xiàn)isher判別函數(shù):f=-3

6、.05212x+4.648898。x為CoroMarker的表達(dá)值，當(dāng)x＞=1.523時，該個體就是CAD患者，x＜1.523時，則為非CAD患者。樣本集模型（100次抽樣對應(yīng)的100個模型）判斷結(jié)果提示:平均正確判別率為0.81，最大正判率為0.89，最小正判率為0.74;其中，冠心病組平均正判率為0.65，最大正判率為0.82，最小正判率為0.50;而對照組平均正判率為0.97，最大正判率為1.00，最小正判率為0.90。冠心病平均

7、正判32例，誤判為對照組18例;對照組平均正判48例，誤判為冠心病2例。該模型判斷最優(yōu)結(jié)果提示:分類總正判率為0.89，其中冠心病組達(dá)到0.80，對照組高達(dá)0.98。冠心病組正判40例，誤判為對照組10例，對照組正判高達(dá)49例，誤判為冠心病只有1例。而ROC分析結(jié)果表明總體樣本中AUC為0.92，95％CI(0.892-0.947)，而第15次抽樣對應(yīng)的訓(xùn)練樣本及驗證樣本中AUC分別為0.905，95％ CI(0.869-0.940)和

8、0.96，95％ CI(0.923-0.997)。危險因素分析結(jié)果提示CoroMarker不受CAD傳統(tǒng)危險因素的影響，單因素及多因素分析結(jié)果提示CoroMarker可作為診斷CAD的獨立危險因素。獨立前瞻性研究結(jié)果提示，該模型能夠分別在50例CAD病人中正判38例，在40例對照組患者中正判37例，相應(yīng)的敏感性和特異性分別為76％和92.5％。相較其他的心血管疾病，CoroMarker在CAD中特異性高表達(dá)。
　　第二章
　

9、　Pathway分析提示，冠心病組外周血單核細(xì)胞上調(diào)差異基因主要參與Jak-STAT signaling pathway，Vascular smooth musclecontraction，Leukocyte transendothelial migration和Metabolic pathways等細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而下調(diào)差異基因主要參與Rheumatoid arthritis，Chemokine signalingpathway,

10、Toll-like receptor signaling pathway, Antigen processing and presentation,Metabolic pathways和Apoptosis等與炎癥、免疫和凋亡相關(guān)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　結(jié)論:
　　(1)首次篩選出CAD病人單核細(xì)胞高表達(dá)的CoroMarker。
　　(2)建立了lncRNA的“CoroMarker分子診斷模型”，可早期預(yù)測CAD的發(fā)生

11、發(fā)展。
　　(3) CoroMarker可通過促進(jìn)單核細(xì)胞增殖和分泌炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致CAD的病理形成。
　　第二部分
　　研究背景和目的:
　　在第一部分研究工作中，我們證實單核細(xì)胞高豐度表達(dá)的CoroMarker可作為早期診斷CAD的一個新型生物標(biāo)志物;在功能初步驗證中，研究分析CoroMarker可通過發(fā)揮促炎和促單核細(xì)胞增殖的作用導(dǎo)致CAD發(fā)生發(fā)展。
　　本實驗的目的就是探討CAD病人動脈血管內(nèi)皮高豐

12、度表達(dá)的CoroMarker在CAD病理形成中的作用及分子機(jī)制。
　　方法:
　　第一章
　　我們運(yùn)用percoll液分選外周血循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，通過qPCR方法研究循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞CoroMarker在CAD組和非CAD組之間的差異表達(dá);在HUVEC細(xì)胞系上，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)shRNA-CoroMarker細(xì)胞系; ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中相關(guān)炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNFα的分泌。
　　第二章
　　運(yùn)用

13、熒光原位雜交和核質(zhì)分離的方法研究CoroMarker在內(nèi)皮細(xì)胞中的亞定位;3，及5'RACE和northern blot的方法獲取并驗證CoroMarker的全長序列;生物信息學(xué)分析CoroMarker可能的作用，并用雙熒光素酶報告基因的方法研究CoroMarker與mir205-5P的直接作用;Wester Blot及qPCR的方法研究基因在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　第一章
　　qPCR結(jié)果表明CoroM

14、arker在冠心病人循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)(5.156±0.896)，95％CI(0.565，1.397)，較對照組患者循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)(0.981±0.176)，95％CI(3.036，7.275)，顯著升高(P＜0.05);對CoroMarker的功能進(jìn)行研究，在成功干擾CoroMarker70％的時候，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL6和TNFα的結(jié)果提示CoroMarker干擾組IL-1β(P=0.

15、0398)、IL6(P=0.000)和TNFα（P=0.017）的分泌較對照組和陰性對照組，皆顯著降低(P＜0.05)，而IL-1β、IL6和TNFα在對照組和陰性對照組之間無明顯差異(P＞0.05)，n=6。
　　第二章
　　熒光原位雜交實驗結(jié)果提示，帶cy3標(biāo)記的CoroMarker主要集中在HUVEC細(xì)胞的胞漿中;核質(zhì)分離實驗的結(jié)果進(jìn)一步證實胞漿中CoroMarker的表達(dá)是細(xì)胞核中的2.5倍。在HUVEC細(xì)胞上，分別

16、通過3'和5'RACE，獲取了CoroMarker的全長序列，共有1394nt;并通過Northern blot實驗進(jìn)一步證實CoroMarker基因條帶對應(yīng)在1500bp附近，和RACE結(jié)果一致。繼而生物信息學(xué)分析提示CoroMarker可以和microRNA205-5P互補(bǔ)結(jié)合;qPCR研究結(jié)果表明干擾CoroMarker組microRNA205-5P的表達(dá)較對照組及干擾陰性對照組皆顯著下降(P＜0.05);雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)

17、果提示，lncRNA可顯著增強(qiáng)miR-205的表達(dá)(P＜0.05)，luciferase活性較對照組增強(qiáng)近2倍。qPCR及WB檢測結(jié)果皆表明作為microRNA205-5P靶基因的PTEN在CoroMarker干擾組中顯著上調(diào)，同時干擾PTEN可使CoroMarker促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌得到部分恢復(fù)。
　　結(jié)論:
　　(1)首次成功鑒定出CAD的致病基因CoroMarker.
　　(2)首次證明CoroMarker主