尿液lncRNA在前列腺癌早期診斷以及新型miRNA在進(jìn)展機(jī)制中的研究.pdf

1、中國前列腺癌(Prostate cancer，PCa)的發(fā)病率和死亡率急劇上升，其增長率位居腫瘤之首。同時(shí)，PCa的防治面臨著兩大臨床難題，即早期診斷指標(biāo)特異性差和晚期治療方法效果不佳。因此，臨床上亟需找到新型的敏感性和特異較高的PCa診斷標(biāo)志物或診斷策略來代替血清PSA或彌補(bǔ)血清PSA在早期診斷上的不足；基礎(chǔ)研究上亟需闡明PCa進(jìn)展的關(guān)鍵分子機(jī)制，從而研發(fā)出抑制去勢(shì)抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prosta

2、te cancer，CRPC)的新型藥物，實(shí)現(xiàn)CRPC治療上的突破。
　　研究目的:
　　研究尿液中長鏈非編碼RNA MALAT1和PCA3評(píng)分在前列腺初次穿刺患者中的診斷作用，建立基于尿液MALAT1或PCA3評(píng)分的綜合診斷模型；探索新型miR-n5在PCa進(jìn)展中的作用機(jī)制，尋找CRPC干預(yù)的新靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增尿沉渣RNA，qRT-PCR檢測(cè)MALAT1和PCA3的表達(dá)，單因素

3、logistic回歸預(yù)測(cè)PCa的危險(xiǎn)因素，多因素logistic回歸建立PCa診斷模型，Spearman rank檢測(cè)分析尿液MALAT1或PCA3評(píng)分與其它臨床變量之間的關(guān)系，運(yùn)用受試者工作曲線(Receiver operating characteristic curve，ROC)確定診斷指標(biāo)的曲線下面積（Area under the ROC，AUC）、最佳截?cái)嘀?、特異度和敏感度，決策曲線分析(Decision curve anal

4、ysis，DCA)來估算尿液MALAT1和PCA3評(píng)分的臨床價(jià)值。Northern blot檢測(cè)新型miRNA的存在與表達(dá)，細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和克隆形成實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)miR-n5在進(jìn)展性PCa細(xì)胞系中的生物學(xué)功能，生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-n5的靶基因，雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證靶基因，GraphPad Prism5進(jìn)行數(shù)據(jù)展示并計(jì)算藥物的IC50，皮下種植和脛骨內(nèi)注射建立CRPC小鼠移植瘤模型。用SPSS v.17.0(SPSS Inc.

5、，Chicago, IL, USA), MedCalc v.10.4.7.0(MedCalc Software bvba, Mariakerke, Belgium)和R軟件包v.3.1.1(The R Foundation for Statistical Computing)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用HemI軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的Heatmap分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　尿液MALAT1和PCA3評(píng)

6、分可以明確區(qū)分腫瘤組和穿刺陰性組患者并與PCa的檢出率高度相關(guān)，但進(jìn)一步的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，尿液MALAT1和PCA3評(píng)分與臨床危險(xiǎn)因素以及Gleason評(píng)分沒有相關(guān)性。年齡、血清總PSA(Total PSA，tPSA)、前列腺體積(Prostate volume，PV)、游離PSA比值（Percentage of free PSA，％fPSA）和直腸指診結(jié)果（Digital rectal examination，DRE）是總體人群的獨(dú)立

7、預(yù)測(cè)因子，而在PSA=4-10ng/ml（PSA“診斷灰區(qū)”）人群中，年齡、PV、％fPSA和DRE是其獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。尿液MALAT1評(píng)分在總體人群中的PCa診斷效能與tPSA相比雖然稍高但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.510)，但在PSA“診斷灰區(qū)”人群中則明顯優(yōu)于tPSA(p=0.034)。PCA3評(píng)分在PSA“診斷灰區(qū)”人群中的PCa診斷效能則明顯優(yōu)于tPSA(p=0.0407)和％fPSA(p=0.046)。進(jìn)一步的logistic回

8、歸分析得出，在發(fā)現(xiàn)組的PSA“診斷灰區(qū)”人群中，基于尿液MALAT1評(píng)分綜合模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性為79.79％和AUC為0.853，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性比基礎(chǔ)模型提高了5.32％，AUC提高了0.0318。將這一模型應(yīng)用到驗(yàn)證組也得到了相同的結(jié)果。同樣，在PSA“診斷灰區(qū)”人群中，基于尿液PCA3評(píng)分綜合模型的AUC也高達(dá)0.819，高于基礎(chǔ)模型的0.788。
　　應(yīng)用DCA，在PSA“診斷灰區(qū)”人群中，不管是在發(fā)現(xiàn)組還是在驗(yàn)證組，基于尿液MA

9、LAT1評(píng)分綜合模型的臨床預(yù)測(cè)能力都優(yōu)于基礎(chǔ)模型。將臨床穿刺風(fēng)險(xiǎn)定為25％，發(fā)現(xiàn)組人群中基于尿液MALAT1評(píng)分綜合模型的總獲益率高于基礎(chǔ)模型(13.97％ vs.11.47％)，且可以避免更多不必要的前列腺穿刺(47.32％ vs.39.78％)；驗(yàn)證組人群基于尿液MALAT1評(píng)分綜合模型的總獲益率同樣高于基礎(chǔ)模型(15.73％ vs.13.11％)，且可以避免更多不必要的前列腺穿刺(30.33％ vs.22.47％)，更為重要的是，

10、綜合模型沒有漏診1例高級(jí)別PCa而基礎(chǔ)模型則漏診1例高級(jí)別PCa。同樣，在PSA“診斷灰區(qū)”人群中，基于PCA3評(píng)分綜合模型幾乎在所有臨床穿刺閾值上優(yōu)于基礎(chǔ)模型，特別是在25％-40％這一區(qū)間顯示出了更好的預(yù)測(cè)作用。應(yīng)用30％這一臨床穿刺閾值，基于PCA3綜合模型可以避免60.3％不必要的穿刺活檢，但以漏診4例PCa為代價(jià)，其中2例為高級(jí)別PCa。
　　此外，應(yīng)用65對(duì)PCa及其癌旁正常組織進(jìn)行RNA-seq發(fā)現(xiàn)300多個(gè)新型mi

11、RNA，并使用Northern blot驗(yàn)證了其中表達(dá)量最高的8個(gè)新型miRNA。通過在進(jìn)展性PCa與惰性PCa細(xì)胞系中的表達(dá)情況比較，篩選出4個(gè)與PCa進(jìn)展相關(guān)的新型miRNA。再通過臨床樣本的驗(yàn)證，最終選取miR-n5作為后續(xù)的研究對(duì)象。體外的功能實(shí)驗(yàn)表明，miR-n5能夠明顯抑制進(jìn)展性PCa細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和克隆形成能力，說明miR-n5的缺失或低表達(dá)可能促進(jìn)了PCa的進(jìn)展。進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了腫瘤內(nèi)注射miR-n5能夠抑

12、制小鼠移植瘤的生長。此后，生物信息學(xué)分析并找到了miR-n5的作用靶基因KDM6B，同時(shí)，通過雙熒光素酶報(bào)告基因及qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)一步的研究表明，KDM6B的特異性抑制劑——小分子化合物GSK-J4能夠抑制KDM6B的活性并明顯抑制PCa細(xì)胞的生長，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明了這一小分子化合物能夠明顯抑制小鼠移植瘤的生長。
　　研究結(jié)論:
　　尿液MALAT1和PCA3是PCa的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，能明確區(qū)分前列腺穿刺陽性和陰性患者

13、，基于尿液MALAT1或PCA3建立的臨床綜合診斷模型可大大提高PCa的臨床診斷效能。尤其在PSA“診斷灰區(qū)”，尿液MALAT1和PCA3的診斷效能明顯高于血清總PSA，基于尿液MALAT1或PCA3建立的臨床綜合診斷模型的預(yù)測(cè)能力高于應(yīng)用臨床危險(xiǎn)因素建立的基礎(chǔ)模型，并能夠避免更多不必要的前列腺穿刺且不會(huì)漏診更多的高級(jí)別PCa。此外，本研究證明了miR-n5在體內(nèi)和體外都能明顯抑制進(jìn)展性PCa的生長，它通過抑制其靶基因KDM6B的表達(dá)發(fā)