補腎活血法治療強直性脊柱炎臨床研究及抗骨化分子機制的探討.pdf

1、強直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,AS)的發(fā)病機制至今不明,脊柱及外周關(guān)節(jié)(尤其是髖關(guān)節(jié))骨化強直可致患者活動能力喪失,嚴重影響患者的生活、工作。因此,抑制或延緩骨化發(fā)生是AS治療的關(guān)鍵,然而,沒有證據(jù)顯示目前的治療方法可以延緩AS骨化的發(fā)生發(fā)展。中醫(yī)中藥在控制AS病情及延緩AS骨化發(fā)生具有巨大的潛能。本論文在導師馮興華教授補腎活血法治療AS學術(shù)思想的指導下,首先對以補腎活血立法組方的補腎強脊湯治療AS的療效與安

2、全性進行系統(tǒng)的綜合的評價:然后以體外培養(yǎng)的AS成纖維細胞系統(tǒng)作為研究對象,采用中藥血清藥理學方法,借助westernblotting技術(shù),在蛋白表達層面從BMP／Smad信號傳導通路探討中藥復方補腎活血方藥抑制AS成纖維細胞向成骨型分化、抗AS骨化作用的可能分子機制。
　　 一理論研究
　　 1通過分析古代醫(yī)籍關(guān)于脊強、腎痹、骨痹、大僂等與AS相似疾病的病因病機的論述,對腰痛、足跟痛、肩背痛等AS相關(guān)癥狀病因病機的闡述,

3、總結(jié)得出AS的發(fā)病當是腎本虛,風、寒、濕、熱、瘀血等邪氣侵襲人體、痹阻經(jīng)脈而致。2導師馮興華教授從事中醫(yī)風濕病治療40余年,在強直性脊柱炎的治療方面享譽盛名,文章從癥狀學的角度總結(jié)導師經(jīng)驗,分析AS發(fā)病的因為與機制。導師認為,提煉為“腎虛是AS的根本因為；風、寒、濕、熱、瘀血是.AS發(fā)病的誘因,是標實的表現(xiàn)”,患者先天不足,或后天失養(yǎng),致使腎虛督空,風、寒、濕、熱等外邪乘虛侵襲人體,痹阻筋脈、經(jīng)絡(luò),或內(nèi)生的濕、熱、瘀血阻滯經(jīng)脈,氣血、水

4、濕運行受阻,瘀滯而致生本病。治療應(yīng)以“補腎活血”為基本原則。
　　 二臨床研究
　　 目的:評價補腎強脊湯治療強直性脊柱炎的有效性和安全性。分別從AS評價(Assessmentinankylosingspondylitis,ASAS)20達標率、Bath強直性脊柱炎疾病活動指數(shù)(BathASdiseaseactivityindex,BASDAI)50達標率、Bath強直性脊柱炎功能指數(shù)(Bathankylosingspo

5、ndylitisfunctionalindex,BASFI)、Bath強直性脊柱炎測量學指數(shù)(Bathankylosingspondylitismetrologyindex,BASMI)等多種療效評價指標,從脊柱疼痛、晨僵、夜間痛等癥狀改善情況,從中醫(yī)證候指標等多個方面與西藥柳氮磺胺吡啶比較,評價補腎強脊湯對腎虛瘀阻型AS患者的療效:并觀察其對患者肝腎功能、心血管、血液系統(tǒng)的影響。
　　 方法:采用隨機分組、對照,將來自于200

6、8年9月至2009年6月中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院風濕病科門診的、90例中醫(yī)辨證為腎虛瘀阻型AS患者分為兩組,中藥組45例,給予補腎強脊方藥煎湯治療,日兩次；西藥組45例,給予柳氮磺胺吡啶1g,口服日兩次,共治療24周。以4周、12周、24周為評價點,分別評價并比較兩組的ASAS20、BASDAI50達標率。以24周為評價點,分別評價兩組治療前后BASDAI、BASFI、BASMI、脊柱疼痛、晨僵、夜間痛、患者總體評價(PGA)及急性時相

7、反應(yīng)物血沉(ESR)和C反應(yīng)蛋白(CRP)的變化情況,以及中醫(yī)證候指標的改善情況,并比較兩組間的差異。
　　 結(jié)果:補腎強脊湯在各評價點(4周、12周、24周)的ASAS20達標率分別為27.27％、65.91％、86.36％,BASDAI50達標率分別為6.98％、27.27％、63.64％,均較西藥組為高。中醫(yī)腎虛血瘀證候總有效率為86.36％,高于西藥組的58.14％。補腎強脊湯可以有效的改善BASDAI、BASFI、BA

8、SMI等的評分,對患者總體評價、脊柱疼痛、夜間痛、晨僵、肌腱端不適等臨床癥狀有明顯緩解作用,對ESR、CRP亦有顯著改善作用。試驗過程中,中藥組患者均未出現(xiàn)不良事件。
　　 結(jié)論:補腎強脊湯治療強直性脊柱炎的療效確切,且起效迅速,療效持久穩(wěn)定。在各評價點(4周、12周、24周)的ASAS20達標率分別為27.27％、65.91％、86.36％,BASDAI50達標率分別為6.98％、27.27％、63.64％,均較西藥組為高。中

9、醫(yī)腎虛血瘀證候總有效率為86.36％,高于西藥組的58.14％?？梢杂行У母纳艫S患者的疾病活動度、軀體功能,改善脊柱疼痛、夜間痛、晨僵、肌腱端不適等相關(guān)臨床癥狀。對AS患者頸椎、腰椎、髖關(guān)節(jié)活動范圍都有很好的改善作用。補腎強脊湯治療AS臨床療效滿意,安全性和依從性良好。
　　 三實驗研究
　　 以國家自然科學基金為依托,本課題以體外培養(yǎng)AS成纖維細胞系統(tǒng)作為研究對象,采用中藥血清藥理學方法,應(yīng)用westernblott

10、ing技術(shù),研究BMP／Smad信號傳導通路在AS成纖維細胞向成骨型分化的作用,并從該通路出發(fā)探討補腎活血方藥抗AS骨化作用的分子機制。
　　 1實驗一rhBMP-2對體外培養(yǎng)的正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞增殖及分化的影響
　　 目的:觀察不同濃度重組入骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhBMP-2)作用下,體外培養(yǎng)的正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞增殖活性及堿性磷酸酶活性,以了解rhBMP-2能否誘導正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞向成骨型分化,為探索B

11、MP-2在AS骨化發(fā)生中的作用提供基礎(chǔ)。
　　 方法:在北京大學人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)矯形中心協(xié)助下,取因外傷骨折需行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者(男性,18—55歲)的髖關(guān)節(jié)囊,采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞。應(yīng)用MTT比色法檢測rhBMP-2(100、200、400ng／ml)刺激成纖維細胞12h、24h、48h、72h,細胞增殖的時效變化；檢測不同濃度rhBMP-2(50、100、200、400、800、1600ng／ml)刺激

12、成纖維細胞24h,細胞生長及增殖量效變化；用酶動力學方法檢測不同濃度rhBMP-2作用下細胞分泌ALP的活性。
　　 結(jié)果:不同濃度的rhBMP-2隨刺激時間的增加均對成纖維細胞的增殖有促進作用,并于刺激24小時后增殖進入高峰,與刺激12小時后增殖情況有顯著差異(P<0.05),與刺激48小時、72小時后的增殖情況沒有顯著差異(P>0.05)。但400ng／ml的rhBMP-2刺激72小時細胞增殖明顯減少。rhBMP-2在較低濃

13、度時對成纖維細胞的增殖即有顯著的促進作用,并隨濃度的升高促進作用增強,與空白對照組間差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.05)。當濃度為200ng／ml時,增殖活性達到最大值,并由此細胞進入增殖的平臺期。同時,成纖維細胞的ALP活性與空白對照組相比,活性均有顯著增加,差異均具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.05),但各濃度組組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論:正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞具有向成骨型分化的潛能,在外源性rh

14、BMP-2的誘導下可以表達成骨表型,并且可以促進細胞增殖。
　　 2實驗研究二BMP／Smad信號傳導通路在體外培養(yǎng)正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞的表達情況
　　 目的:驗證BMP-2可以開啟正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞向成骨型分化的信號傳導通路。觀察正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞在rhBMP-2刺激下,信號蛋白Smad1、Smad4的表達情況,以及Smad1磷酸化的水平,證實正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞在BMP-2的刺激下BMP／Smad

15、信號傳導通路活化。
　　 方法:在北京大學人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)矯形中心協(xié)助下,取因外傷骨折需行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者(男性,18-55歲)的髖關(guān)節(jié)囊,采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞。應(yīng)用蛋白印跡westernblotting法檢測在200ng／mlrhBMP-2刺激不同的時間(2h、6h、12h、24h)后,正常成纖維細胞中pSmad1、Smad1及Smad4的表達情況。
　　 結(jié)果:正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞在受到rh

16、BMP-2的刺激后,pSmad1、Smadl、Smad4表達量都較未有受到BMP-2刺激組的表達量要高。pSmad1在受到rhBMP-2刺激6h后表達即顯著升高(差異有顯著性,P<0.05),隨之持續(xù)穩(wěn)定的表達(與12h組、24h組比較,差異沒有顯著性,P>0.05)。Smadl蛋白受到刺激6h后表達有所增加,與空白對照組及2h組相比差異有顯著性(P<0.05),并隨時間的增加其表達量逐漸升高。Smad4蛋白在受到rhBMP-2刺激后,

17、表達量明顯增加,刺激24小時后表達量增加尤為明顯(與空白對照組及2h、6h、12h.組對比,P<0.05)。
　　 結(jié)論:BMP-2可以刺激正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞的BMP／Smad信號傳導通路活化。正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞在受到外源性rhBMP-2刺激后信號蛋白Smad1發(fā)生磷酸化,Smad1和Smad4表達上調(diào),顯示BMP-2啟動了正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞BMP／Smad的級聯(lián)反應(yīng),激活BMP／Smad通路的信號傳導。表明正

18、常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞中的BMP／Smad信號傳導通路具有進一步活化的潛能,正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞在rhBMP-2誘導下向成骨型分化可能是由于BMP-2激活了BMP／Smad信號傳導通路。
　　 3實驗研究三BMP／Smad通路在強直性脊柱炎成纖維細胞中的表達情況
　　 目的:通過與正常人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞比較,觀察AS髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞中pSmad1、Smad1及Smad4的表達情況,以了解AS髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞中B

19、MP／Smad信號傳導通路是否處于活化狀態(tài)。并用rhBMP-2刺激AS成纖維細胞,觀察成骨標志基因Cbfa-1的表達變化,證實BMP／Smad信號傳導通路活化可以誘導AS成纖維細胞向成骨型轉(zhuǎn)化。
　　 方法:在北京大學人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)矯形中心及北醫(yī)三院骨科的協(xié)助下,取因外傷骨折需行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者(男性,18-55歲)的髖關(guān)節(jié)囊以及全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)AS患者的髖關(guān)節(jié)囊,采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞。應(yīng)用蛋白印跡wes

20、ternblotting法檢測AS成纖維細胞和正常成纖維細胞中pSmad1、Smad1和Smad4的表達情況。然后用rhBMP-2刺激AS成纖維細胞48h后,用westernblotting方法檢測其Cbfa-1表達的變化。
　　 結(jié)果:在AS成纖維細胞中pSmad1、Smad1、Smad4的表達都較正常成纖維細胞多(P<0.05)。在rhBMP-2的刺激下,Cbfa-1表達量明顯增加(與AS成纖維細胞組相比,差異具有顯著性,P

21、<0.05)。
　　 結(jié)論:BMP／Smad信號傳導通路的活化是AS髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞向成骨型分化的可能機理之一,可能是AS骨化發(fā)生的機制之一。AS髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞中pSmad1、Smad1、Smad4蛋白表達上調(diào),BMP／Smad信號傳導通路在AS成纖維細胞中處于活化狀態(tài)。而AS成纖維細胞在BMP-2的誘導下Cbfa-1表達升高,表達成骨表型。
　　 4實驗研究四補腎活血方藥對AS成纖維細胞BMP／Smad信號傳導通

22、路的影響
　　 目的:驗證補腎活血方藥可以通過抑制BMP／Smad信號傳導通路活化,抑制相關(guān)蛋白pSmad1、Smad1、Smad4的表達而抑制AS成纖維細胞向成骨型分化,從而發(fā)揮抗AS骨化作用。
　　 方法:在北京大學人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)矯形中心及北醫(yī)三院骨科的協(xié)助下,取因外傷骨折需行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者(男性,18-55歲)的髖關(guān)節(jié)囊以及全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)AS患者的髖關(guān)節(jié)囊,采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人髖關(guān)節(jié)囊成纖維細胞。將成纖維

23、細胞分成正常成纖維細胞組、AS成纖維細胞組、AS成纖維細胞+BMP組、AS成纖維細胞+BMP+對照血清組、AS成纖維細胞+BMP+含藥血清組,根據(jù)分組情況細胞培養(yǎng)48h后,應(yīng)用westernblotting技術(shù)檢測各組中Cbfa-1、Smad1、Smad4及pSmad1的表達情況。
　　 結(jié)果:AS成纖維細胞在受到rhBMP-2的刺激后,成骨標志基因Cbfa-1表達顯著提高,而使用了含藥血清處理的AS成纖維細胞Cbfa-1的表達

24、則受到抑制,二者的差異具有顯著性(P<0.005)。rhBMP-2刺激AS成纖維細胞后,Smad1蛋白明顯發(fā)生磷酸化,pSmad1的表達量顯著增多(P<0.001),Smad1、Smad4表達亦增加；而使用了補腎活血方藥含藥血清處理的成纖維細胞其pSmad1、Smad1、Smad4的表達較AS+BMP組的表達降低,差異具有顯著性(P<0.001),與AS+BMP+對照血清組比較表達量具有顯著差異性(P<0.001)。
　　 結(jié)論