Hemin誘導K562細胞向紅系細胞分化和胞質(zhì)雜交體的蛋白質(zhì)組學及NPM1功能的初步研究.pdf

1、隨著生命科學研究的發(fā)展和深入，細胞分化、去分化和再分化逐漸成為生命科學領域研究的熱點。研究表明，在基因水平利用基因?qū)牖蚣毎こ碳夹g，可以糾正遺傳物質(zhì)缺陷及基因表達異常，使失控的癌細胞向正常方向轉化。此外，蛋白質(zhì)組學技術的發(fā)展為腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制的研究提供了新思路。因此在基因和蛋白質(zhì)水平研究細胞分化、去分化和再分化的機制可為腫瘤的發(fā)生及治療提供重要依據(jù)。
　　 正常情況下，哺乳類紅細胞終末分化是由骨髓造血干細胞依次歷經(jīng)紅系定向祖

2、細胞、原幼紅細胞、早幼紅細胞、中幼紅細胞、晚幼紅細胞和網(wǎng)織紅細胞等不同的發(fā)育分化階段，其終末分化的主要特征是分化的紅系細胞停止分裂并開始表達血紅蛋白，細胞體積逐漸縮小、細胞核固縮、偏位、自然排核等，形成網(wǎng)織紅細胞，通過血腦屏障進入到外周血中發(fā)育為成熟紅細胞。在正常分化過程中如果受到物理、化學、環(huán)境等因素的影響，紅系細胞則停止分化，異常增殖，細胞停滯在分化階段，珠蛋白等終末分化相關基因關閉，細胞發(fā)生癌變。這些明顯的分化特征是紅系細胞特有的

3、，而其它類型細胞所不具備的。
　　 據(jù)報道，已有多種細胞分化誘導劑如:氯高鐵血紅素(hemin)、二甲基亞砜(Dimethysulfoxide，DMSO)、丁酸鈉(Sodiumbutyrate，NaBu)、六甲基烯二乙酰胺（Hexamethylenebisacetamide，HMBA）和全反式維甲酸(ATRA)等，這些誘導劑可在體外誘導紅白血病細胞，使細胞發(fā)生重編程，重新進入紅系分化階段，細胞增殖速度減慢，珠蛋白基因開啟并表達血

4、紅蛋白。
　　 此外，胞質(zhì)雜交體模型是研究胞質(zhì)因子對細胞調(diào)控的很好模型，該模型是利用正常分化的無細胞核的網(wǎng)織紅細胞與異常分化的骨髓瘤細胞進行細胞融合，經(jīng)篩選即可獲得胞質(zhì)雜交體(cybride)。由于胞質(zhì)雜交體中的網(wǎng)織紅細胞的胞質(zhì)因子可以調(diào)控腫瘤細胞的生長，使腫瘤細胞惡性逆轉。
　　 迄今，研究與紅系分化相關的特異性調(diào)節(jié)因子主要集中在紅系分化早期階段，而時序性進入紅系終末分化，尤其是與正常紅系細胞排核相關的調(diào)控因子尚無確切

5、報道，而白血病細胞的核增殖和分裂是失控的。深入、系統(tǒng)地研究并闡明細胞的分化與去分化（癌變）的機制，是生命科學領域研究的熱點和難點。
　　 本論文選用誘導劑Hemin誘導K562細胞向紅系分化和小鼠網(wǎng)織紅細胞與人K562細胞融合得到的胞質(zhì)雜交體這兩個實驗模型作為研究對象，利用蛋白質(zhì)組學方法結合質(zhì)譜技術高通量地篩選哺乳類紅系終末分化過程中差異表達的蛋白質(zhì)，從中篩選與分化、去分化相關的因子，蛋白質(zhì)復合體乃至構建網(wǎng)絡調(diào)控系統(tǒng)。這些調(diào)控因

6、子的鑒定對于闡明紅系細胞終末分化的機制及開發(fā)治療紅白血病的靶向特異性藥物具有重要的理論意義和臨床應用價值。
　　 Hemin誘導K562細胞向紅系分化系統(tǒng):利用Hemin作為分化誘導劑誘導K562細胞向紅系分化，用聯(lián)苯胺染色檢測紅系分化的指標，即血紅蛋白的表達;用細胞計數(shù)法和MTT比色法分別檢測hemin對K562細胞增殖和細胞活力的影響;用流式細胞術和免疫細胞化學等方法對hemin誘導K562細胞分化前后細胞周期分布、紅系分化

7、表面標志等進行時序性觀測。同時利用雙向電泳偶聯(lián)質(zhì)譜技術，結合生物信息學分析了hemin誘導的K562細胞在紅系分化過程中差異表達的蛋白質(zhì)，經(jīng)分析鑒定從中篩選差異蛋白并對其功能進行初步研究。
　　 胞質(zhì)雜交體系統(tǒng):用鹽酸苯肼誘發(fā)小鼠網(wǎng)織紅細胞，利用細胞融合技術，將小鼠網(wǎng)織紅細胞與K562細胞進行細胞融合，構建了胞質(zhì)雜交體。并通過抗性篩選獲得穩(wěn)定細胞株。在基因水平上對其分別在細胞分化、增殖、凋亡、癌基因等方面進行鑒定;用MTT比色法

8、檢測了胞質(zhì)雜交體的細胞活力，利用雙向電泳偶聯(lián)質(zhì)譜技術及生物信息學分析了網(wǎng)織紅細胞胞質(zhì)因子在對K562細胞調(diào)控過程中差異表達的蛋白質(zhì)，并從篩選重要的蛋白質(zhì)進行功能研究。
　　 hemin誘導K562細胞分化結果表明:K562細胞經(jīng)hemin誘導24h時，K562細胞已經(jīng)表達血紅蛋白，聯(lián)苯胺染色呈陽性，說明K562細胞已經(jīng)開始向紅系分化，隨著誘導時間的延長誘導率逐漸升高，且每個時間點隨著誘導劑濃度的升高，誘導效率逐漸升高，96h時，

9、40μM的hemin誘導效率達到72％;細胞生長曲線和MTT檢測細胞活力的實驗結果表明:hemin對K562細胞的增殖和細胞活力有一定的影響，但在一定時間范圍內(nèi)不同濃度的hemin對K562細胞的細胞活力影響不明顯;流式細胞儀檢測細胞細胞周期結果表明:hemin并未影響K562細胞的細胞周期分布;免疫細胞化學檢測了紅系分化的表面標志TER119和GPA的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)兩種蛋白在細胞分化過程中都有表達且主要定位在細胞膜和細胞質(zhì)中;雙向

10、電泳分離了hemin誘導K562細胞分化前后表達的差異蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定有66個蛋白差異表達，經(jīng)生物信息學分析對這些蛋白按功能進行了分類并做了初步總結，主要包括以下幾類:血紅蛋白及其合成相關的蛋白、mRNA轉錄和加工及蛋白質(zhì)翻譯修飾相關的蛋白、氧化還原代謝相關的蛋白、細胞遷移及細胞骨架系統(tǒng)相關蛋白、各種代謝相關的酶類、細胞應激反應相關蛋白及一些功能未知的蛋白。
　　 胞質(zhì)雜交體的實驗結果表明:小鼠網(wǎng)織紅細胞與K562細胞經(jīng)細胞融合

11、和篩選獲得了穩(wěn)定的細胞株MR.K562;其增殖相關基因c-myc表達下調(diào)，紅系分化特異性基因gata-1表達上調(diào);MTT實驗檢測穩(wěn)定株的細胞活力，結果表明與正常K562細胞相比MR.K562細胞增殖速度減慢，對hemin的敏感性增強;通過雙向電泳和質(zhì)譜鑒定，該模型鑒定出64個差異蛋白，并對這些蛋白依功能進行了分類和初步總結，功能分類主要包括:能量代謝相關蛋白、信號通路相關蛋白、蛋白質(zhì)合成、轉錄調(diào)控、運輸、細胞周期、細胞凋亡、細胞遷移及細

12、胞骨架系統(tǒng)相關、細胞增殖相關蛋白及一些功能未知的蛋白。
　　 另一重要發(fā)現(xiàn)是核仁磷酸蛋白(Nucleophosmin，NPM1)在這兩個系統(tǒng)中均有差異表達，據(jù)報道NPM1是個多功能蛋白，其在核糖體合成、中心體復制、組蛋白分子伴侶、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等多方面都發(fā)揮重要功能，但其在哺乳動物紅系分化中功能尚未明確。此外，本實驗前期研究也發(fā)現(xiàn)NPM1在丁酸鈉(SB)誘導MEL細胞向紅系分化中表達下調(diào)、胎肝造血系統(tǒng)中亦差異表達，故選擇核仁

13、磷酸蛋白NPM1對其在哺乳動物紅系分化中進行初步功能研究。(1)應用Westernblot驗證了NPM1在誘導分化和胞質(zhì)雜交體中均差異表達。(2)應用RNA干擾技術和過表達技術分別構建pLKO.1-NPM1干擾載體和pLJM-NPM1過表達載體，用慢病毒包裝技術侵染K562細胞并篩選獲得了NPM1低表達的K562-NPM1-shRNA穩(wěn)定株和NPM1過表達的K562-pLJM-NPM1穩(wěn)定株。(3)通過MTT實驗和Hemin誘導分化實驗

14、，檢測NPM1低表達和過表達分別對K562細胞的活力和分化能力的影響。(4)運用串聯(lián)親和純化(TAP)結合質(zhì)譜技術分離鑒定與NPM1相互作用的蛋白質(zhì)復合體，此部分實驗正在進行中。為進一步探討NPM1在紅系分化過程中的功能及作用機制奠定理論和實驗基礎。
　　 綜上所述，本論文選取了兩個研究紅系分化的模型，其優(yōu)勢在于，hemin誘導K562細胞向紅細分化是利用化學誘導劑直接作用于有核的K562細胞，重新開啟其珠蛋白基因，誘導其重編程