溫莪術(shù)內(nèi)生真菌突變株代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌是指寄居于健康植物組織或細(xì)胞內(nèi)而不引起宿主產(chǎn)生明顯病癥的一類微生物。其代謝產(chǎn)物種類豐富、生理活性多樣，是抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等天然活性物質(zhì)的重要來源。
　　本文主要采用活性追蹤的方法，研究了藥用植物溫莪術(shù)內(nèi)生真菌突變株的次級代謝產(chǎn)物，旨在獲得天然活性物質(zhì)，為制備植物藥用有效成分探索新途徑。內(nèi)容包括:溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的分離、鑒定及活性菌株的篩選;活性菌株EZG0807分子生物學(xué)鑒定及其生物學(xué)性質(zhì)研究;利用超導(dǎo)磁體模

2、擬空間環(huán)境條件對菌株EZG0807進(jìn)行誘變及其突變株的篩選;突變株M7226發(fā)酵條件優(yōu)化;菌株M7226次級代謝產(chǎn)物的分離、純化及其結(jié)構(gòu)表征;菌株M7226次級代謝產(chǎn)物生物活性研究。結(jié)果如下：
　　(1)采用組織塊表面消毒法從溫莪術(shù)根、莖和葉中分離得到66株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，分別歸屬于5目、7科、14屬，其中優(yōu)勢屬為青霉屬（Penicillium）、鐮孢霉屬（Fusarium）和曲霉屬（Aspergillus）;抗菌活性實驗

3、結(jié)果顯示溫莪術(shù)根部內(nèi)生真菌EZG0807對四種指示細(xì)菌（Escherichia coli、Proteus vulgaris、Bacillus subtilis和Staphylococcus aureus）和四種指示真菌(Microzyme、Aspergillus niger、Rhizopus和Mucor)均具有較強的抑制作用;該菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和真菌ITS序列分析，鑒定為Gibberellamoniliformis，命名為Gibbere

4、lla moniliformis EZG0807，并將其ITS序列提交至GenBank，登錄號為JQ003920。
　　(2)利用大梯度超導(dǎo)磁體模擬空間環(huán)境對G.moniliformis EZG0807進(jìn)行誘變，并采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對其誘變機制進(jìn)行探索，實驗結(jié)果表明:大梯度超導(dǎo)磁體模擬空間環(huán)境條件使出發(fā)菌株G.moniliformis EZG0807DNA條帶發(fā)生缺失，導(dǎo)致基因突變。
　　(3)采用稀釋涂布平板法對誘變

5、后菌株G.moniliformis EZG0807分離和純化，得到139株突變菌株;經(jīng)濾紙片抑菌法初篩和MTT法抗腫瘤細(xì)胞活性實驗復(fù)篩，得到1株高活性且遺傳穩(wěn)定的突變菌株M7226。與出發(fā)菌株G.moniliformis EZG0807相比，M7226發(fā)酵液對四種指示細(xì)菌E.coli、P.vulgaris、B.subtilis和S.aureus的抑制能力均有所提高，對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、肺癌細(xì)胞H460、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和

6、人肝癌細(xì)胞HepG2均有較強的抑制作用，統(tǒng)計學(xué)上均具有顯著性差異。
　　(4)利用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計，優(yōu)化突變菌株M7226的發(fā)酵條件，得到最佳發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度29℃，初始pH值6.8，發(fā)酵時間10d。在此條件下，經(jīng)發(fā)酵放大和組合分離、純化方法，從其發(fā)酵液中獲得5個單體化合物。利用波譜技術(shù)并結(jié)合理化性質(zhì)確定5個化合物分別為姜黃素、肉桂酸、1，4-二羥基蒽醌、赤霉酸和山奈酚。
　　(5) MIC法體外檢測5個化

7、合物對四種指示菌（E.coli、P.vulgaris、B.subtilis和S.aureus)的抑制作用，結(jié)果顯示:①姜黃素和1，4-二羥基蒽醌對四種指示菌均有較強的抑制作用，且呈濃度依賴性，其中姜黃素對E.coli、P.vulgaris、B.subtilis和S.aureus的MIC值分別為200、200、200和50μg/mL;1，4-二羥基蒽醌對E.coli、P.vulgaris、B.subtilis和S.aureus的MIC值分

8、別為200、400、400和200μg/mL;②赤霉酸、山奈酚和肉桂酸對四種指示菌抑制作用不顯著，MIC值均大于400μg/mL。
　　(6) Alamar Blue法檢測5個化合物對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、肺癌細(xì)胞H460和人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示:①姜黃素對HepG2、H460、MCF-7和A549的增殖均具有較強的抑制作用，IC50值分別為14.12、24.65、20.25和16.4

9、2μg/mL;②山奈酚的抗腫瘤活性次之，對HepG2、H460、MCF-7和A549的IC50值分別為60.47、90.22、90.95和129.60μg/mL;③當(dāng)赤霉酸濃度為200μg/mL作用時間為24 h，對HepG2增殖的抑制率達(dá)24.8％;④當(dāng)肉桂酸濃度為200μg/mL作用時間為24 h，對A549的抑制率達(dá)13.1％;⑤1，4-二羥基蒽醌對四種腫瘤細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用，但作用效果相對較弱。
　　(7)利用影

10、像學(xué)技術(shù)，通過Hoechst33258染色法、AO/EB雙熒光染色法及活體細(xì)胞在線培養(yǎng)觀察人肝癌細(xì)胞HepG2經(jīng)姜黃素作用后細(xì)胞形態(tài)的變化。Hoechst33258染色結(jié)果顯示:HepG2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀亮藍(lán)色熒光，細(xì)胞表現(xiàn)出核質(zhì)濃縮、核仁破裂等凋亡特征;AO/EB雙熒光試驗結(jié)果表明:HepG2細(xì)胞隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞變得稀疏，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核碎裂呈點狀，被染成大小不一、致密濃染的橘黃色顆粒;活體細(xì)胞在線培養(yǎng)觀察結(jié)果

11、顯示:HepG2細(xì)胞皺縮、胞體變小、染色質(zhì)濃縮成碎片狀、質(zhì)膜下陷包裹核碎片和細(xì)胞器，出現(xiàn)凋亡小體;在此過程中未觀察到細(xì)胞膜的破裂、內(nèi)容物的釋放，表明姜黃素能夠促使HepG2細(xì)胞凋亡，而不是導(dǎo)致細(xì)胞壞死。上述形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果均表明，經(jīng)姜黃素作用后的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征。
　　(8)RT-PCR試驗結(jié)果表明:經(jīng)姜黃素作用后的HepG2細(xì)胞，Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)、Bax、Caspase3和Caspase8基因表達(dá)上調(diào)，揭示姜