三氧化二砷及AFP反義表達(dá)載體誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 肝癌是目前全球最常見的癌癥之一，作為一種發(fā)病率高、惡性程度高、死亡率高且高轉(zhuǎn)移的癌癥，目前尚無切實有效的治療方法。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)及細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的進(jìn)展，越來越多的生物學(xué)治療方法被用于肝癌的治療，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡就是其中之一。
　　 三氧化二砷在治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)方面已取得很好的臨床療效，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)其在肝

2、癌等實體瘤的實驗治療中也有較好的作用效果。但目前對不同肝癌細(xì)胞細(xì)胞株的作用效果有何差異，很少有人進(jìn)行橫向研究比較。
　　 甲胎蛋白(a-fetoprotein.AFP)被認(rèn)為是人類發(fā)現(xiàn)的第一個真正有價值的腫瘤標(biāo)記物。AFP作為一種免疫抑制性蛋白質(zhì)，可抑制免疫攻擊，促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長?；贏FP在肝癌發(fā)生發(fā)展中的特殊作用，以AFP為靶點的基因治療一直是相關(guān)研究中的熱點之一。
　　 本課題以AFP陽性肝癌細(xì)胞系HepG2和He

3、p3B，AFP陰性肝癌細(xì)胞系SMMC-7721及正常肝細(xì)胞Changliver四株不同的肝癌細(xì)胞為研究對象，分別觀察ATO對它們的作用效果。同時，構(gòu)建AFP反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞系，抑制該基因表達(dá)活性，再結(jié)合As2O3，觀察其協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的變化。本研究將化學(xué)藥物與基因治療相結(jié)合，立足探尋一種新的肝癌治療方法，并取得了顯著效果，此為臨床醫(yī)學(xué)實踐提供了科學(xué)依據(jù)。
　　 研究方法
　　 1、三氧化二砷抗腫瘤活性的研究

4、
　　 1)MTT法檢測細(xì)胞存活率；
　　 2)Giemsa染色檢測細(xì)胞核的變化；
　　 3)Hochest33324染色檢測細(xì)胞核的皺縮；
　　 4)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與凋亡；
　　 5)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測NF-κB的變化；
　　 2、AFP反向載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的研究
　　 1)AFP表達(dá)載體的構(gòu)建；
　　 2)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染AFP表達(dá)載體；
　　 3)RT-PC

5、R檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)AFP mRNA的表達(dá)；
　　 4)Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中AFP的表達(dá)；
　　 5)MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的存活率；
　　 6)流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞周期與凋亡；
　　 3、三氧化二砷聯(lián)合AFP反義表達(dá)載體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究
　　 1)MTT法測定反義載體和ATO聯(lián)合作用及ATO單獨作用時細(xì)胞存活率的變化；
　　 2)流式細(xì)胞術(shù)檢測反義載體轉(zhuǎn)染

6、后ATO作用24小時與pEGFP空載體轉(zhuǎn)染后ATO作用24小時HepG2細(xì)胞周期與凋亡率的變化。
　　 研究結(jié)果
　　 1、ATO對AFP陽性肝癌細(xì)胞HepG2和Hep3B的生長有明顯的抑制作用，而對AFP陰性肝癌細(xì)胞SMMC-7721及正常肝細(xì)胞Changliver的作用效果不明顯。
　　 2、ATO作用于HepG2和Hep3B后，出現(xiàn)明顯的凋亡特征。而SMMC-7721僅有個別細(xì)胞出現(xiàn)凋亡特征，Changli

7、ver沒有明顯的凋亡特征。
　　 3、ATO作用于HepG2和Hep3B后，G0/G1期細(xì)胞和凋亡細(xì)胞大量增加。SMMC-7721只有G2/M期的細(xì)胞比例有所升高，其它各期和凋亡率變化都不大。Changliver則足各個時期變化均不大。
　　 4、ATO作用于HepG2和Hep3B后，凋亡早期NF-κB的表達(dá)量增加。
　　 5、反義載體轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B后，AFP-mRNA的量明顯降低，AFP蛋白的表達(dá)量

8、減少。
　　 6、反義載體轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B后，細(xì)胞存活率降低。反義載體轉(zhuǎn)染HepG2后，各時期細(xì)胞變化不大，但細(xì)胞凋亡率增加。
　　 7、反義載體和ATO聯(lián)合作用于HepG2和Hep3B與只用ATO處理相比，細(xì)胞存活率減少，而對于SMMC-7721和Changliver，細(xì)胞存活率變化不大。
　　 8、對于HepG2，與轉(zhuǎn)染空載體后用ATO處理相比，轉(zhuǎn)染AFP反義載體后再用ATO處理時，細(xì)胞被大量阻滯在

9、G0/G1期和G2/M期，細(xì)胞凋亡率明顯增加。
　　 結(jié)論
　　 1、研究發(fā)現(xiàn)AFP陽性的肝癌細(xì)胞HepG2和Hep3B對ATO的敏感性比AFP陰性肝癌細(xì)胞SMMC-7721以及正常肝細(xì)胞Changliver要強。
　　 2、ATO能夠誘導(dǎo)AFP陽性肝癌細(xì)胞HepG2和Hep3B發(fā)生凋亡，使其細(xì)胞周期大部分阻滯在G0/G1期。
　　 3、在三氧化二砷誘導(dǎo)HepG2和Hep3B細(xì)胞凋亡的早期伴隨著NF-κB