產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶弗勞地檸檬酸桿菌的研究.pdf

1、目的：
　　 碳青霉烯類抗生素是治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)和AmpC酶腸桿菌科細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染的一線藥物。近年來(lái)，腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)一類新型的質(zhì)粒介導(dǎo)AmblerA類β-內(nèi)酰胺酶-肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KlebsiellapneumoniaeCarbapenemase，KPC)，是近10年來(lái)最常見的碳青霉烯酶之一。該酶能夠水解碳青霉烯類抗生素，造成對(duì)包括亞胺培南、美羅培南在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，而且對(duì)相當(dāng)一

2、部分非β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥。本文擬通過(guò)篩選出對(duì)亞胺培南耐藥或敏感性下降的腸桿菌科細(xì)菌并檢測(cè)相關(guān)耐藥基因，以期了解近年來(lái)本地區(qū)產(chǎn)KPC腸桿菌科細(xì)菌的分布狀況；對(duì)KPC型碳青霉烯酶基因在菌株間的轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行分析，研究KPC型碳青霉烯酶基因的播散機(jī)制。
　　 方法：
　　 應(yīng)用VITEK-60型全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)亞胺培南耐藥或敏感性下降的腸桿菌科細(xì)菌初次分離株進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。PCR擴(kuò)增及測(cè)序檢測(cè)亞胺培南耐藥或敏感性下降的

3、腸桿菌科細(xì)菌KPC基因，對(duì)KPC陽(yáng)性菌進(jìn)行AmpC酶頭孢西丁三維試驗(yàn)、ESBLs檢測(cè)、金屬酶初篩試驗(yàn)、等電聚焦及PCR擴(kuò)增測(cè)序(AmpC酶、ESBLs和金屬酶)相關(guān)基因，分析確定KPC陽(yáng)性菌產(chǎn)生的所有β-內(nèi)酰胺酶的類型。接合轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和Southernblot試驗(yàn)驗(yàn)證blaKPC是否位于質(zhì)粒上以及質(zhì)粒是否可接合轉(zhuǎn)移。采用Etest法檢測(cè)KPC陽(yáng)性菌、接合子或轉(zhuǎn)化子菌MIC值。對(duì)編碼blaKPC的質(zhì)粒測(cè)序并分析其周圍序列。
　　 結(jié)

4、果：
　　 1．菌株篩選和藥敏結(jié)果：分離到一株攜帶KPC型碳青霉烯酶基因弗勞地檸檬酸桿菌，弗勞地檸檬酸桿菌對(duì)亞胺培南及頭孢菌素類抗生素均呈現(xiàn)高水平耐藥，對(duì)美羅培南為中介耐藥，對(duì)氨曲南、氨芐西林和復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥且MICs均＞256μg/ml，但轉(zhuǎn)化子對(duì)亞胺培南及頭孢菌素類抗生素呈現(xiàn)敏感性下降，氨芐西林在轉(zhuǎn)化子中的MICs仍為＞256μg/ml。
　　 2．β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)：弗勞地檸檬酸桿菌金屬酶初篩結(jié)果為陰性；經(jīng)頭孢噻

5、肟和頭孢噻肟/克拉維酸雙紙片協(xié)同法檢測(cè)，弗勞地檸檬酸桿菌產(chǎn)ESBLs；頭孢西丁三維試驗(yàn)陽(yáng)性(即AmpC酶陽(yáng)性)；通過(guò)等電聚焦電泳發(fā)現(xiàn)弗勞地檸檬酸桿菌含有等電點(diǎn)為5.4和6.7的β-內(nèi)酰胺酶條帶，推測(cè)pI5.4的為TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶和pI6.7的為KPC-2型碳青霉烯酶，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其它β-內(nèi)酰胺酶條帶。
　　 3．耐藥基因檢測(cè)：經(jīng)PCR檢測(cè)，弗勞地檸檬酸桿菌中KPC型碳青霉烯酶基因陽(yáng)性，經(jīng)測(cè)序與GenBank序號(hào)EF0625

6、08的序列一致，為blaKPC-2；ESBLs基因PCR檢測(cè)及測(cè)序發(fā)現(xiàn)弗勞地檸檬酸桿菌攜帶blaTEM-1和blaCTX-M-3；AmpC酶基因PCR檢測(cè)及測(cè)序判斷弗勞地檸檬酸桿菌攜帶染色體AmpC基因；未檢測(cè)到IPM型和VIM型金屬酶基因。
　　 4．接合轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，未得到接合子。將從原始菌株抽提的質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入受體菌中，經(jīng)亞胺培南篩選獲得轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR和DNA測(cè)序，證實(shí)blaKPC-2、blaTEM-1和bl

7、aCTX-M-3基因陽(yáng)性，但未檢測(cè)到AmpC酶基因。
　　 5．質(zhì)粒譜分析：質(zhì)粒電泳顯示，臨床分離菌含有3個(gè)質(zhì)粒，分別約為50kb、4kb和2.5kb，轉(zhuǎn)化子含1個(gè)質(zhì)粒，約為50kb。
　　 6．KPC-2型碳青霉烯酶基因定位及周圍序列分析：Southernblot證實(shí)臨床分離株和轉(zhuǎn)化子的50kb質(zhì)粒上顯示blaKPC-2特異性DNA探針雜交信號(hào)，大腸埃希菌V517質(zhì)粒上沒(méi)出現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)，染色體碎片上出現(xiàn)弱檢測(cè)信號(hào)。bla

8、KPC-2基因周圍序列中含有多個(gè)轉(zhuǎn)座相關(guān)元件，在blaKPC-2和blaTEM-1的上游有ISKpn8轉(zhuǎn)座酶基因和一個(gè)由tnpR+tnpA構(gòu)成的Tn3樣轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，在blaKPC-2和blaTEM-1下游有一個(gè)ISKpn6-樣轉(zhuǎn)座酶基因。
　　 結(jié)論：
　　 首次在溫州地區(qū)分離到一株產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的弗勞地檸檬酸桿菌，在菌株中檢出blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTX-M-3和AmpC基因，blaTEM