腸道產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶細(xì)菌特性及產(chǎn)生機(jī)制研究.pdf

1、產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）細(xì)菌自2001年被發(fā)現(xiàn)以來就迅速在多個國家和地區(qū)蔓延，并逐年增加，由于缺乏針對由這類細(xì)菌引起感染的有效治療藥物，因此產(chǎn)KPC酶細(xì)菌的流行已成為全球抗感染的難題，有關(guān)KPC的研究已成為抗感染領(lǐng)域?qū)＜已芯康闹攸c之一。
　　由于產(chǎn)KPC酶細(xì)菌在很短時間內(nèi)在多個國家和地區(qū)被快速分離到，而且大多數(shù)國家中第一例攜帶產(chǎn)KPC酶細(xì)菌的患者均無流行

2、病學(xué)史，幾乎所有國家第一例被分離到的產(chǎn)KPC酶細(xì)菌均為腸桿菌科細(xì)菌，所以我們推斷腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)在產(chǎn)KPC酶細(xì)菌的發(fā)生發(fā)展上起到重要作用。
　　為了探索腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)在產(chǎn)KPC酶細(xì)菌產(chǎn)生上的作用及碳青霉烯類抗生素耐藥菌定植與腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的相互作用關(guān)系，本研究從以下幾個方面進(jìn)行了研究。
　　一、ICU患者腸道碳青霉烯類抗生素不敏感菌的分離狀況研究
　　本研究收集了我院重癥監(jiān)護(hù)室(Intensive Care

3、Unit，ICU)247個患者從入ICU第一天起每五天一次直至出院的糞便/直腸拭子標(biāo)本，共429份。用含1μg/ml美羅培南的麥康凱平板培養(yǎng)基對這429份標(biāo)本進(jìn)行了培養(yǎng)，共得到細(xì)菌286株。對這286株細(xì)菌進(jìn)行了鑒定和藥物敏感性（簡稱藥敏）試驗，其中171株對美羅培南或亞胺培南耐藥或中度敏感，剔除重復(fù)菌株后得到119株碳青霉烯類抗生素不敏感細(xì)菌，攜帶率為48.2％(119/247)。對這119株細(xì)菌進(jìn)行了菌種分布及耐藥性的分析，并用脈沖

4、場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)分析了其中的鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和植生拉烏爾菌的同源性。和同年ICU臨床分離株的相應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)腸道分離的碳青霉烯類抗生素不敏感菌中有一些臨床不常見細(xì)菌，如植生拉烏爾菌、解鳥氨酸拉烏爾菌、多食博克霍爾德菌、甜菜假單胞菌、彎曲假單胞菌、少動嗜銅菌等，這些細(xì)菌可能成為新耐藥菌產(chǎn)生的“儲備庫”。還發(fā)現(xiàn)腸道分離的碳青霉烯

5、類抗生素不敏感菌中腸桿菌科細(xì)菌比例為31.1％，明顯高于臨床分離株的12.1％，這符合腸道菌群構(gòu)成特點。PFGE發(fā)現(xiàn)腸道分離菌的同源性顯著低于臨床分離株，這也表明腸道分離的碳青霉烯類抗生素不敏感菌并非來自醫(yī)院流行的克隆，同時這種克隆多樣性也增加了新的耐藥克隆產(chǎn)生和流行的概率。這些不同于臨床分離株的特點提示了腸道中碳青霉烯類抗生素不敏感菌的發(fā)生發(fā)展有其獨特的規(guī)律。
　　二、用PCR法檢測腸道分離的blaKPC陽性細(xì)菌并探索其產(chǎn)生機(jī)制

6、
　　本部分用PCR法檢測了所有286株從糞便/直腸拭子中篩查到的細(xì)菌及從429份糞便/直腸拭子提取的宏基因組中的KPC酶編碼基因（blaKPC）。共檢測到40株blaKPC陽性細(xì)菌，有肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、植生拉烏爾菌和奇異變形桿菌，其攜帶的KPC均為KPC-2。
　　分別用Etest、PFGE、接合試驗、轉(zhuǎn)化試驗、Southern雜交及PCR步移法對在我國首次發(fā)現(xiàn)的3株blaKPC陽性銅綠假單胞菌和2株

7、blaKPC陽性植生拉烏爾菌進(jìn)行了耐藥性、同源性、blaKPC基因定位及其基因環(huán)境研究。發(fā)現(xiàn)3株銅綠假單胞菌為同一克?。≒FGE型相同，序列分型均為ST463），均為全耐藥菌，攜帶多種耐藥基因(PER、TEM-1，aac(3)-Ⅱ，aac(6')-Ⅱ及rmtB）并缺失oprD2基因。它們的blaKPC定位在染色體上，blaKPC基因及周圍的2646-bp核苷酸序列和中國流行的blaKPC-2周圍結(jié)構(gòu)的變異體2相同。2株植生拉烏爾菌為不同

8、克隆，但都為除了對多粘菌素B和多黏菌素敏感外的廣泛耐藥菌株，都攜帶CTX-M-1、TEM-1和qnrA基因。blaKPC定位在質(zhì)粒上，包括blaKPC在內(nèi)的7498-bp周圍序列和在中國流行的質(zhì)粒pKP048攜帶的blaKPC-2兩側(cè)的序列完全一致。
　　有12份糞便/直腸拭子標(biāo)本能直接從DNA中擴(kuò)增到blaKPC，但不能用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)到blaKPC陽性的細(xì)菌。這可能是因為blaKPC存在于常規(guī)培養(yǎng)不能得到的細(xì)菌中。這些細(xì)菌可能正

9、是產(chǎn)KPC酶腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生的源頭。
　　三、碳青霉烯類抗生素耐藥菌定植的腸道微生物分子生態(tài)特征研究
　　本部分應(yīng)用多末端限制性片段長度多態(tài)性(Multiplex-terminal restrictionfragment length polymorphism，M-TRFLP)技術(shù)，對三組標(biāo)本（①無碳青霉烯類抗生素耐藥菌定植組20份，②KPC陰性碳青霉烯類抗生素耐藥菌定植組20份，③KPC陽性碳青霉烯類抗生素耐藥菌定植組20

10、份）進(jìn)行了細(xì)菌、真菌及古菌的多樣性分析。發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類抗生素耐藥菌定植時真菌和古菌的末端限制性片段長度多態(tài)性（Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）有顯著改變，揭示了腸道微生物生態(tài)失衡與耐藥菌定植密切相關(guān)。
　　以上研究表明:
　　1.腸道分離的碳青霉烯類抗生素不敏感菌有不同于臨床分離菌的顯著特征:
　　(1)腸桿菌科細(xì)菌比例明顯高于臨床分離株

11、，這符合腸道菌群構(gòu)成特點。
　　(2)腸道內(nèi)有臨床不常見的碳青霉烯類抗生素不敏感菌，這些細(xì)菌可能成為新耐藥菌產(chǎn)生的“儲備庫”。(3)腸道分離的碳青霉烯類抗生素不敏感菌同源性明顯低于臨床分離細(xì)菌，說明這些細(xì)菌不是臨床流行的克隆傳播所致，同時這種克隆多樣性增加了新的耐藥克隆產(chǎn)生和流行的概率。
　　2.blaKPC可能存在于常規(guī)手段培養(yǎng)得不到的細(xì)菌上，這些細(xì)菌可能是產(chǎn)KPC酶腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生的源頭。
　　3.我們首次在國內(nèi)分

12、離到了產(chǎn)KPC酶銅綠假單胞菌和植生拉烏爾菌，它們分別為全耐藥菌和廣泛耐藥菌，攜帶的blaKPC分別定位于染色體和質(zhì)粒上。銅綠假單胞菌的blaKPC基因及周圍的2646-bp核苷酸序列和中國流行的blaKPC.2周圍結(jié)構(gòu)的變異體2相同。植生拉烏爾菌的blaKPC基因及兩側(cè)7498-bp的序列和在中國流行的質(zhì)粒pKP048攜帶的blaKPC.2兩側(cè)的序列完全一致。
　　4.耐藥菌定植與無耐藥菌定植時的腸道真菌及古菌的種群結(jié)構(gòu)有明顯差異