鈍頂節(jié)旋藻cpcB基因上游序列結(jié)構(gòu)功能的研究.pdf

1、以綠色熒光蛋白基因(gfp)為報告基因，構(gòu)建了由鈍頂節(jié)旋藻藻藍蛋白cpcB基因上游序列驅(qū)動的綠色熒光蛋白表達載體，通過熒光顯微鏡檢測和流式細胞儀證明，GFP能夠在大腸桿菌中表達。SDS-PAGE分析表明，GFP在37℃條件下的表達水平約占菌體總蛋白的16％左右，推測在藻藍蛋白基因上游序列中可能存在較強的啟動子元件。并且GFP在大腸桿菌中的表達受到培養(yǎng)溫度的影響，溫度越高，表達水平越高。對翻譯起始區(qū)(TIR)的軟件分析和突變分析顯示，一種

2、RNA的特殊二級結(jié)構(gòu)(RNA溫度計)與溫度的影響有關(guān)，在鈍頂節(jié)旋藻藻藍蛋白cpcB基因的TIR中，可能也存在這種結(jié)構(gòu)。 啟動子分析軟件預測顯示，在cpcB基因上游序列中存在6條啟動子，并采用定點突變方法分離，實驗證明每條啟動子均能單獨控制GFP表達。通過流式細胞儀對GFP表達水平分析顯示，第三條啟動子的強度最高，第四條次之。通過對第三條啟動子-35元件(TTCTCA)的點突變分析發(fā)現(xiàn)，C和T兩個堿基對保持啟動子的強度是非常重要的

3、，任何突變均可引起GFP表達量嚴重下降。 在cpcB基因上游序列中有6個短的開放閱讀框，其中三個可能具有編碼功能，推測這些開放閱讀框或其基因產(chǎn)物可能參與藻藍蛋白基因的表達調(diào)控。在-321-371的區(qū)域富含AT(90％)，它的缺失引起GFP表達水平下降，說明該AT區(qū)域?qū)幼拥幕钚杂写龠M作用。 采用SmartRace技術(shù)對藻藍蛋白基因的轉(zhuǎn)錄特征進行了分析。在藻體內(nèi)藻藍蛋白基因只有一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從PCR產(chǎn)物的大小和對轉(zhuǎn)錄起始

4、位點的分析可知，基因的轉(zhuǎn)錄是由第一條啟動子決定的。還克隆了節(jié)旋藻其他品系的cpcB基因的部分上游序列和編碼區(qū)的部分序列。所擴增的片段長度分別為474bp，包括257bp的上游序列和217bp的編碼區(qū)序列。所克隆的上游序列，以及FACHB438，F(xiàn)ACHB793和FACHB790的cpcB基因編碼區(qū)序列未見報道。從比對結(jié)果看，供試的7個序列的堿基變異不大。在474bp中，共有31處變異，其中上游序列21處，編碼區(qū)10處，且變異主要集中在F

5、ACHB439，其他序列僅個別堿基的改變。cpcB基因的上游序列的相似性表明，不同品系的節(jié)旋藻的藻藍蛋白基因可能存在共同的表達調(diào)控機制。 通過同源重組的方法，將藻藍蛋白基因上游序列及其驅(qū)動的gfp基因整合到聚球藻Synechococcussp.PCC7942的基因組中，通過熒光顯微鏡檢測和流式細胞儀證明，GFP能夠在其中表達，從而構(gòu)建了以異源藍藻為宿主的報告基因表達系統(tǒng)。并考察了光強對GFP表達的影響。實驗證明，光強對GFP表達

6、的有一定的影響。光強在10μmolm-2s-1時，GFP表達水平最高。當?shù)陀?0μmolm-2s-1時，光強度越小，GFP表達水平越低。當光強大于10μmolm-2s-1時，光強度越高，GFP表達水平反而越低。通過cpcB基因上游序列5'端缺失分析，在-218至-276的區(qū)域可能存在光反應(yīng)元件。 在該報告系統(tǒng)還考察了硫、磷、氮、鐵等元素缺乏對GFP表達的影響。在營養(yǎng)元素缺乏的情況下，GFP的表達水平均有不同程度的下降。其中，硫元