鈍頂節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB341藻藍(lán)蛋白基因上游序列功能研究.pdf

1、在本實(shí)驗(yàn)室先前的工作中已經(jīng)證實(shí)，鈍項(xiàng)節(jié)旋藻(Arthrospira platensisFACHB341)藻藍(lán)蛋白操縱子上游的419bp中有6條啟動(dòng)子序列，本文研究了該上游序列各啟動(dòng)子中與啟動(dòng)強(qiáng)度有關(guān)的因素。我們選擇6條啟動(dòng)子中表達(dá)水平較高的3條啟動(dòng)子promoter 3、promoter 4和promoter 6，對(duì)其中3號(hào)啟動(dòng)子的-10元件和-35元件、4號(hào)啟動(dòng)子的-10元件及6號(hào)啟動(dòng)子的-35元件進(jìn)行不同位點(diǎn)多種形式的誘變處理，流式

2、細(xì)胞儀分析GFP的表達(dá)水平檢測(cè)啟動(dòng)子強(qiáng)度。通過(guò)-35元件與-10元件中單堿基的改變對(duì)報(bào)告基因的表達(dá)的影響，分析不同堿基在啟動(dòng)子中所起作用的主次和強(qiáng)弱。 TaKaRa MutanBEST Kit用來(lái)進(jìn)行定點(diǎn)突變，結(jié)果表明，3號(hào)啟動(dòng)子的-10元件突變后，各突變株GFP表達(dá)量明顯上升，達(dá)原表達(dá)量的2-4倍；3號(hào)啟動(dòng)子的-35元件突變后，GFP表達(dá)量均下降，減少到原表達(dá)量的2-4％；而4號(hào)啟動(dòng)子的-10元件與6號(hào)啟動(dòng)子的-35元件突變后

3、，不同突變株的表達(dá)量有上升也有下降。實(shí)驗(yàn)證明了-35區(qū)與-10區(qū)在保持啟動(dòng)子功能方面的重要作用，對(duì)闡明藻藍(lán)蛋白基因啟動(dòng)子的作用機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并為藍(lán)藻基因工程提供了強(qiáng)有力的啟動(dòng)元件。 啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控中重要的順式元件，其結(jié)構(gòu)與功能的研究成為分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。但目前的啟動(dòng)子研究還存在許多問(wèn)題，很多啟動(dòng)子上的序列功能我們到現(xiàn)在為止還不完全清楚，特別是國(guó)內(nèi)外有關(guān)藻類啟動(dòng)子方面的研究很少，尚未見到有關(guān)藻類啟動(dòng)子研究進(jìn)展的

4、綜述性報(bào)道。如果能了解其研究現(xiàn)狀，找出不足，指導(dǎo)未來(lái)啟動(dòng)子研究的方向，將會(huì)對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的研究起到促進(jìn)作用?；诖四康模覀冋砹艘黄C述文章，介紹了植物基因啟動(dòng)子的研究方法與概況，重點(diǎn)綜述了藻類基因啟動(dòng)子的研究現(xiàn)狀，介紹了本實(shí)驗(yàn)室對(duì)節(jié)旋藻藻藍(lán)蛋白基因啟動(dòng)子的研究情況，并就啟動(dòng)子在基因工程中應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了討論。 另外，先前工作證明，將節(jié)旋藻FACHB341品系于25℃，光照強(qiáng)度40μmlo.m<'-2>.s<'-1>條件下培養(yǎng)，

5、進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，結(jié)果只有一條啟動(dòng)子，即1號(hào)啟動(dòng)子參加了轉(zhuǎn)錄調(diào)控。另外，通過(guò)以大腸桿菌DH5α和聚球藻(Synechococcus sp.PCC7942)為表達(dá)載體分別證明了溫度、光強(qiáng)的變化會(huì)影響啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP報(bào)告基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步分析其作用機(jī)制，我們?cè)跇O端溫度、光強(qiáng)條件下培養(yǎng)節(jié)旋藻，采用SmartRace技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，看特定的條件下該基因的轉(zhuǎn)錄特征是否變化。結(jié)果證明在溫度分別為15℃、35℃，光強(qiáng)分別為10μmol.m<'-2