節(jié)旋藻色基裂合酶基因cpcS,cpcT,cpcU的克隆及在有光學活性藻藍蛋白β亞基生物合成中的功能研究.pdf

1、鈍頂節(jié)旋藻(Arthrospira platensis)是一種具有很高營養(yǎng)價值的經(jīng)濟微藻,其富含藻藍蛋白,藻藍蛋白具有抗氧化,抗腫瘤等作用,還可作為一種天然色素,廣泛用于醫(yī)藥、食品、化妝等行業(yè),此外由于其所特有的熒光活性且無毒,還可用作熒光標記物及光動力治療等領域。近年來,通過基因工程手段表達具有光學活性藻藍蛋白研究取得了較多的成果,為有光學活性藻藍蛋白的應用及構建新的光合系統(tǒng)提供了基礎。
　　光學活性藻藍蛋白的合成過程中重要的一

2、步是藻藍膽素與脫輔基蛋白的共價偶聯(lián),而藻藍膽素與脫輔基蛋白的正確連接需要特定的色基裂合酶的催化。光學活性藻膽蛋白的生物合成一般需要脫輔基藻藍蛋白(CpcA,CpcB),色基合成酶(Hox1,PcyA),色基裂合酶三種元件的共同參與。本實驗室前期關于節(jié)旋藻藻藍蛋白α亞基的色基裂合酶的研究已經(jīng)比較完整,但是還沒有關于節(jié)旋藻藻藍蛋白β亞基色基裂合酶的研究,因此本論文克隆了節(jié)旋藻藻藍蛋白β亞基的色基裂合酶,并研究了其功能。
　　本論文首次

3、克隆了鈍頂節(jié)旋藻A. platensis FACHB314的色基裂合酶基因cpcS,cpcT和cpcU,其中cpcS全長594bp,編碼197個氨基酸序列,分子量為22.1kDa,blastp比對其屬于CpeS superfamily,存在5個保守結構域,分別是THHL,ENH,LRERGYAEI,YETM和ERF,氨基酸序列的同源比對結果顯示與其他藍藻的序列相似度為72.52％;cpcT基因全長597bp,編碼198個氨基酸殘基,等電

4、點為5.29,分子量為22.8kDa,blastp比對其屬于CpeT superfamily,具有FSN,NPP,AHI,RPL,EQAY,PYR和FKG七個保守結構域,氨基酸序列的同源比對結果顯示與其他藍藻的序列相似度為71.14%;cpcU基因全長525bp,編碼174個氨基酸殘基,等電點為5.30,分子量為19.2kDa,blastp比對其屬于CpeS superfamily,具有7個保守域,分別是EFF,SAGKWFS,GKS,

5、 EER,PNLR,ASF和SEIR,氨基酸序列的同源比對結果顯示與其他藍藻的序列相似度為73.22%。
　　為了研究節(jié)旋藻的色基裂合酶CpcS,CpcT和CpcU在藻藍蛋白β亞基與藻藍膽素結合過程的作用,本實驗構建了3個重組表達載體:pACYCDuet-cpcB-cpcS(含有藻藍蛋白β亞基基因cpcB和色基裂合酶 cpcS基因), pACYCDuet-cpcB-cpcT(含有藻藍蛋白β亞基基因cpcB和色基裂合酶cpcT基因)

6、和pACYCDuet-cpcB-cpcU(含有藻藍蛋白β亞基基因cpcB和色基裂合酶cpcU基因),并將這3個載體和pACYCDuet-cpcB(僅含有藻藍蛋白β亞基基因cpcB)分別與pET24-hox1-pcyA(含有色基合成酶hox1和pcyA基因)一起轉入大腸桿菌BL21中,構建重組表達菌株BS,BT,BU和B,并誘導蛋白表達,SDS-PAGE和Western Blotting檢測蛋白的表達情況,熒光光譜檢測重組蛋白的熒光強度,

7、結果顯示重組菌株中均表達出了藻藍蛋白,而且有色基裂合酶存在的菌株比沒有色基裂合酶的菌株表達的藻藍蛋白的熒光強度高,而且熒光發(fā)射峰更接近天然藻藍蛋白,說明色基裂合酶對光學活性藻藍蛋白β亞基的合成具有一定的催化作用。
　　為了進一步研究這三個色基裂合酶在藻藍蛋白β亞基上的作用位點,通過將節(jié)旋藻藻藍蛋白β亞基82位和153位的半胱氨酸分別進行突變,突變成丙氨酸,構建突變菌株B(C82A)S,B(C153A)S,B(C82A)T,B(C1

8、53A)T,B(C82A)U和B(C153A)U。通過比較突變菌株與未突變菌株表達的藻藍蛋白的熒光強度來分析色基裂合酶的作用位點。結果顯示,突變菌株B(C82A)T與未突變菌株BT的單位質量藻藍蛋白的熒光強度基本保持一致,而突變菌株B(C153A)T的單位質量藻藍蛋白熒光強度比未突變菌株要低,因此推斷色基裂合酶CpcT的作用位點是β亞基153位的半胱氨酸;而突變菌株B(C153A)S與未突變菌株BS相比,單位質量藻藍蛋白的熒光強度基本沒

9、有變化,而突變菌株B(C82A)S的熒光強度發(fā)生下降,因此推斷裂合酶CpcS的作用位點為β亞基82位的半胱氨酸;突變菌株B(C153A)U與未突變菌株BU相比,單位質量藻藍蛋白的熒光強度基本沒有變化,而突變菌株B(C82A)U的熒光強度發(fā)生下降,因此推斷裂合酶CpcU的作用位點也為β亞基82位的半胱氨酸。
　　本研究首次克隆并研究了節(jié)旋藻中藻藍蛋白β亞基色基裂合酶CpcS,CpcT和CpcU的功能,為闡明節(jié)旋藻中有光學活性藻藍蛋白