硒代胱氨酸及其衍生物的抗腦膠質瘤機理及神經保護機制研究.pdf

1、人腦膠質瘤來源于神經上皮組織，是顱內原發(fā)性腫瘤中最常見的類型，近年來呈患病率增高及患者年輕化的趨勢。目前腦膠質瘤的治療仍然是一個難題，對人類生命健康造成嚴重威脅，因此，尋找更好的抗膠質瘤藥物具有十分重要的意義。
　　糖尿病最易并發(fā)腦血管病變，持續(xù)的高血糖引發(fā)嚴重的神經毒性，使患者神經功能受損，預后不良。因此，除了降血糖外，迫切需要有效措施抑制高血糖毒性，改善神經病損，促進神經功能恢復，進而提高臨床治療效果。
　　腦卒中是人類

2、災難性疾病，是世界范圍內死亡和長期致殘的三大原因之一，同時也是世界上單病種導致成人后天功能障礙的首位原因。因此，探索高效的抗氧化神經保護劑對腦缺血再灌注損傷的改善及治療具有重要的研究意義和臨床價值。
　　硒是人體必需的微量元素，對人體生命活動必不可少，可發(fā)揮抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、拮抗重金屬等多種作用。已證實，硒對維持正常神經功能發(fā)揮有重要作用;而硒缺乏可影響神經認知功能及導致神經退行性變，如阿爾茨海默病、帕金森病。大量臨床及

3、動物研究證據(jù)顯示，高劑量的硒能加劇氧化應激，通過誘導活性氧族物質(ROS)的累積誘導氧化損傷，發(fā)揮促凋亡的功效;而低劑量的硒則具有拮抗氧化應激、抑制細胞凋亡的作用。故人們常常采用高劑量硒作為腫瘤化療制劑，誘導腫瘤細胞周期阻滯，甚至凋亡，以達到抑癌、抗癌目的;而采用低劑量硒作為細胞保護劑，對抗機體內的氧化應激損傷。硒代胱氨酸(SeC)是自然可獲取的小分子有機硒化合物，被稱為人類第21個必需氨基酸，因其多重藥理學功效得到廣泛應用，尤其是其對

4、氧化還原通路的調節(jié)引起眾多研究者的高度關注。3,3'-二硒二丙酸(DSePA)是SeC的衍生物，性質穩(wěn)定、安全性高，具有高效的抗氧化活性，廣泛用于抗氧化研究，在體外和體內實驗中對急性神經毒性和慢性神經退行性病變均表現(xiàn)出保護效果。
　　據(jù)報道，硒缺乏可大大增加機體患癌風險，而補充硒可降低某些癌癥的發(fā)病率。SeC具有廣譜的抗腫瘤活性，可通過誘導凋亡在體內、外抑制多種人類腫瘤細胞生長，如肝癌、肺腺癌、乳腺癌及黑色素細胞瘤，具有潛在的臨床

5、應用價值。近幾年研究還發(fā)現(xiàn):硒化合物聯(lián)合抗腫瘤藥物一起使用，可增強抗腫瘤藥物的敏感性，即硒化合物可作為腫瘤化療的增敏劑。然而，SeC是否對腦膠質瘤細胞的生長具有抑制作用，其機制如何，目前尚未見有報道。
　　大腦屬于高耗氧器官，神經元對葡萄糖的高消耗必然伴隨自由基的大量產生;而高血糖會破壞細胞內的抗氧化酶系，削弱其清除能力，使大量自由基無法被及時清除。持續(xù)高血糖可影響和破壞線粒體內膜，啟動線粒體膜電位耗散，導致大量自由基外泄。過多自

6、由基的沉積，會氧化質膜，破壞神經突觸，擾亂神經元之間的連接，甚至導致神經元凋亡。實驗證實，拮抗高血糖誘導的氧化應激損傷可明顯減弱神經損傷/毒性，改善神經病變。然而，有機硒是否對高糖誘導的神經毒性有拮抗作用，其機制如何，目前尚未見有報道。
　　急性缺血性腦卒中發(fā)作中，腦缺血再灌注損傷的病理機制復雜，氧化還原平衡的破壞是其重要的病理特征。氧化應激通過ROS超載導致脂質過氧化和DNA損傷，在缺血再灌注腦損傷中發(fā)揮關鍵作用。因此，探索高效

7、的抗氧化神經保護劑對腦缺血再灌注損傷的改善及治療具有重要的研究意義和臨床價值。而硒對腦缺血再灌注的直接保護作用，尚未見有研究報道。
　　故本課題開展了在神經系統(tǒng)疾病方面，SeC及其衍生物DSePA的作用研究，探討有機硒對腦膠質瘤、高糖神經毒性、缺血性腦卒中的作用效果及機理。首先，本研究選取了人腦膠質瘤細胞系U251、U87為研究對象，研究SeC對U87和U251細胞周期的影響，同時從影響腫瘤信號轉導通路的重要信號蛋白MAPKs和A

8、KT入手，分析其可能的作用機制，為人腦膠質瘤的治療提供實驗依據(jù)。其次，本研究選取PC12細胞作為神經細胞模型，選用DSePA對高糖誘導的毒性損傷進行干預，探討其對高糖神經毒性的拮抗作用。最后，本研究構建了短暫性局灶性腦缺血再灌注(transient focal cerebral ischemia/reperfusion injury，tFCI/R)損傷小鼠模型，以SeC進行干預，探討其對缺血再灌注損傷的保護作用及機制。
　　目的：

9、
　　1.探究SeC對U251、U87兩種人腦膠質瘤細胞系的生長抑制效果，并探討其潛在的分子機制。
　　2.探究DSePA在PC12細胞中對高糖誘導神經毒性的拮抗效果及機制。
　　3.探究SeC對tFCI/R損傷小鼠的保護功效及機制。
　　方法：
　　1.取對數(shù)生長期U251和U87細胞體外培養(yǎng)，待細胞貼壁后隨機分為正常對照組、各劑量SeC用藥組。分別以5、10、20μM的SeC處理24 h或48 h。使用

10、相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)學變化;采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定細胞生存率，了解SeC對U251和U87細胞生長的抑制;應用流式細胞術分析SeC對U251和U87細胞周期分布的影響;TUNEL-DAPI法觀察SeC對U251細胞DNA的損傷情況;采用DCFH-DA探針和超氧陰離子試劑盒檢測ROS和超氧陰離子的產生;Western blotting檢測SeC對U251中細胞周期調控相關蛋白Cyclin A，細胞凋亡相關蛋白p21、

11、p53及細胞內相關信號通路的蛋白水平（MAPKs及AKT）的影響。同時，應用SeC聯(lián)合多種通路蛋白抑制劑研究其對細胞周期分布的影響。
　　2.取對數(shù)生長期PC12細胞體外培養(yǎng)，待細胞貼壁后隨機分為正常對照組、DSePA用藥組，100 mM葡萄糖處理48 h制作高糖損傷細胞模型，加入DSePA進行干預。采用流式細胞分析技術及TUNEL-DAPI共染色觀察細胞凋亡情況;檢測caspase-3/-8/-9活性，結合Western blo

12、tting結果確定凋亡路徑;通過JC-1探針評價線粒體膜電位，Mito-tracter與DAPI共染色檢測線粒體結構改變，MitoSOX染料檢測超氧陰離子;采用DCFH-DA檢測細胞內ROS水平，并加入ROS清除劑進一步證實氧化損傷的作用;使用Western blotting法檢測相關蛋白表達。
　　3.手術制作tFCI/R小鼠模型，通過多普勒血流監(jiān)測和神經功能缺損評分篩選手術合格的小鼠，隨機分至SeC治療組(SeC)和溶媒對照組

13、(Vehicle)，同時設假手術對照組（Sham，小鼠經歷手術全程而不進行大腦中動脈阻塞）。SeC組小鼠給予術后連續(xù)3日，每日1次腹腔注射SeC溶液(2 mg/30 g)，Vehicle組和Sham組小鼠給予同樣方式注射等量生理鹽水。于術后24、48、72 h各進行一次神經功能缺損評分及神經行為學測試;手術3天后行TTC染色測腦梗死體積，干-濕重法測腦水腫程度變化，免疫熒光染色觀察AQP4表達情況，TUNEL-DAPI染色觀察神經元凋亡

14、情況，Western blotting檢測活性caspase-3和活性caspase-9表達。
　　結果：
　　1.MTT結果顯示，SeC時間/劑量依賴性地抑制了U251和U87細胞的生長，鏡下觀察可見細胞變圓，突觸減少，細胞數(shù)目明顯減少，與正常細胞相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);流式細胞術結果表明SeC處理誘導了明顯的U251和U87細胞S期細胞周期阻滯，這與cyclinA蛋白表達下調相一致;TUNEL-DAPI

15、分析和ROS檢測結果顯示，SeC處理導致了ROS升高誘導的U251細胞DNA損傷;Western blotting結果表明，SeC處理顯著上調了DNA損傷標志物p21和p53的表達，并引起pJNK、p38、pERK的表達上調和pAKT的表達下降。
　　2.DSePA的預處理可有效減弱高糖對PC12細胞的毒性作用。流式細胞技術檢測到，DSePA預處理可顯著抑制高糖誘導的PC12細胞凋亡，表現(xiàn)為sub-G1峰的降低;熒光染色技術結果表

16、明，DSePA預處理可有效抑制高糖誘導的染色質的斷裂和核濃縮。caspases活性檢測顯示DSePA抑制了高糖誘導的caspases活性，Western blotting術從蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)，高糖誘導的PARP切割和caspase-3/-7/-9激活被DSePA預處理顯著抑制;線粒體膜電位及結構檢測證實，DSePA阻斷了高糖誘導的線粒體損傷。DSePA抑制了PC12細胞中高糖誘導的超氧陰離子產生和ROS累積。
　　3.tFCI/R

17、術后24、48、72 h神經功能缺損評分與神經行為學測試表明，隨時間延長，所有小鼠神經功能損傷及感覺運動功能障礙均得到一定程度的改善，而SeC治療組改善顯著，與Vehicle組相比有統(tǒng)計學差異;SeC治療組在手術3天后腦梗死體積和水腫程度上較Vehicle組均有明顯降低，AQP4的表達比Vehicle組顯著降低，表明SeC明顯緩解了腦組織的梗死和水腫;TUNEL-DAPI染色、Western blotting結果表明，SeC處理顯著下調

18、了caspase-3和PARP的裂解，從而抑制了神經元凋亡。
　　結論：
　　1.SeC劑量/時間依賴地抑制人腦膠質瘤細胞的增殖，其分子機制為通過調節(jié)MAPKs和AKT信號通路誘導人腦膠質瘤細胞S期阻滯。
　　2.DSePA可通過抑制氧化應激誘發(fā)的細胞凋亡，拮抗高糖神經毒性，有望成為拮抗高糖誘導神經系統(tǒng)疾病的高效策略。
　　3.腹腔注射SeC對小鼠腦缺血再灌注損傷確有保護功效，主要是通過抑制水腫，抵抗氧化作用誘導