BMSC在微泡及BiAb輔助下修復心肌纖維化的實驗研究及PⅢNP對冠心病合并代謝綜合征患者的預測價值.pdf

1、病理性心肌纖維化是心血管疾病中的一個重要研究課題[2]。近年來,干細胞移植在缺血性心臟病的治療領域顯示出獨特的魅力。盡管在藥物干預、介入治療和外科手術方面取得了可喜的進展,使心肌纖維化的癥狀改善,閉塞的血管再通,但是心肌細胞缺乏增殖能力,對于已經梗死的心肌細胞和纖維化的心肌尚無辦法使其恢復并發(fā)揮正常的舒縮功能。20世紀90年代以來,隨著干細胞生物工程的蓬勃開展[3],具有多向分化潛能和自我復制能力的干細胞給心血管疾病的治療帶來了新的突破

2、性的進展。
　　 在細胞心肌成形術中,常用的干細胞有骨髓間充質干細胞(bonemarrow mesenchymfl stem cell,BMSC)、造血干細胞、內皮祖細胞、胚胎干細胞、骨骼肌成肌細胞等。BMSC取材方便、數量豐富、免疫排斥性低、不存在倫理爭議[4]、能分化為心肌細[5],這些優(yōu)點使BMSC成為細胞心肌成形術治療中的較優(yōu)選擇[6]。
　　 干細胞移植修復損傷心肌具有廣闊的臨床應用前景,但一些亟待解決的瓶頸問

3、題制約著細胞心肌成形術的發(fā)展應用。隨著研究不斷深入,人們發(fā)現移植入的干細胞有效歸巢到受損靶位的數量極少[7,8]。這直接影響了干細胞的修復效果。此外,干細胞修復心肌纖維化的病理生理機制尚不完全清楚。
　　 經靜脈移植BMSC安全性高、易操作,但靶向性差、效率低。因此找尋一種既能從靜脈移植,又能提高移植效率的方法極為重要。同時,這種方法若能增加BMSC的歸巢率、優(yōu)化歸巢微環(huán)境,將使纖維化心肌的修復效果事半功倍。
　　 近年

4、來研究發(fā)現,超聲微泡不僅是一種可以用于增強超聲組織灰階顯像的造影劑,而且可作為一種新型的藥物或基因運載工具。將特定的藥物或基因與微泡結合在一起,通過外周血管注射,經體外超聲定位輻照破壞與之結合的微泡,可使藥物或基因在特定組織內定位釋放,微泡破裂后引起機械效應和空化效應可使靶組織內毛細血管內皮間隙增寬或破裂,基因或藥物可進入特定的組織內[8]。前期研究顯示超聲微泡可促進肝細胞生長因子成功轉移至大鼠缺血心肌,促進血管新生,微血管密度有明顯的

5、增加[9]。亦有研究證實,超聲破壞微泡可增加局部血管內皮細胞胞膜粘附分子的表達,從而促進骨髓單個核細胞粘附于內皮上,基于這些理論基礎,超聲破壞微泡技術是否可以作為一種新型的促進干細胞定向移植的有效方法有待進一步進行探討。
　　 CD29抗體是BMSC表面高表達的分子標志;抗肌凝蛋白輕鏈抗體(anti-myosin light chain antibody,AMLCA)是損傷心肌特異性抗體。AMLCA能與心室肌特異性地結合,而與肝

6、、脾、腎等非肌性組織以及骨骼肌、血管和腸平滑肌無交叉反應。有研究發(fā)現,急性心肌損傷發(fā)生后AMLCA可通過破裂的肌細胞膜與壞死心肌結合,而不是與細胞膜完整的正常心肌細胞結[9]。本課題首先構建CD29×AMLCA這一雙特異性抗體(bispecific antibody,BiAb),然后將BiAb和超聲輻照微泡作為增效措施,輔助BMSC移植入心肌纖維化小鼠,檢測BMSC歸巢率的變化,同時探討B(tài)MSC修復心肌纖維化的可能機制。
　　

7、除了對BMSC在增效措施下干預心肌纖維化的效果和機制進行探討外,本課題還開展了心肌纖維化血漿標志物PⅢNP預測冠心病合并代謝綜合征患者近期心臟重塑及預后的探索性研究。在冠心病人群中,許多患者同時合并代謝綜合征,如何客觀衡量并預測這類患者的心血管重塑程度,并判斷其預后,具有重要臨床價值。間質膠原代謝失衡是心血管重塑的重要形態(tài)基礎,血漿膠原標志物PⅢNP與慢性心衰、急性心梗相關。冠心病合并代謝綜合征患者罹患慢性心衰的風險較大,這類人群的心血

8、管重塑引起心功能惡化、動脈順應性下降,活動耐力降低。血漿膠原標志物PⅢNP在冠心病合并代謝綜合征患者中意義如何,與動脈粥樣硬化疾病及其危險因素的相關性尚不完全清楚。此部分研究用血漿膠原標志物PⅢNP判斷冠心病合并代謝綜合征患者的近期心血管重塑程度,并預測其發(fā)展趨勢,探尋心肌纖維化血漿標志物對預后的判斷價值。
　　 綜上,本課題主要包括以下五部分內容:
　　 第一部分心肌纖維化模型制備及其膠原沉積機制
　　 目的:

9、建立理想的心肌纖維化小鼠模型并探討其膠原沉積機制。方法:將BALB/c小鼠隨機分為實驗組和對照組,每組10只。實驗組予以腹部皮下注射異丙腎上腺素50mg/kg,每天2次,連續(xù)10天。對照組同法注射生理鹽水。45天后處死小鼠,天狼猩紅染色觀察心臟Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量,熒光定量PCR檢測心臟基質金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases-9,MMP-9)、基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissueinhibitor o

10、f metalloproteinase-1,TIMP-1)基因表達,免疫組化染色分析心、肝、腎組織層粘連蛋白(laminin,LN)的表達。結果:實驗組小鼠心臟膠原沉積較多,MMP-9、TIMP-1、LN表達上調(p＜0.05),肝、腎組織LN無明顯改變(p＞0.05)。結論:異丙腎上腺素能制備理想的心肌纖維化小鼠模型,其機制與心臟MMP-TIMP失衡有關。
　　 第二部分小鼠骨髓間充質千細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　 目

11、的:建立一種分離、培養(yǎng)小鼠骨髓間充質干細胞(BMSC)的穩(wěn)定方法,并通過形態(tài)學、細胞表型、功能學指標進行鑒定。方法:無菌分離小鼠股骨,以全骨髓貼壁法培養(yǎng)BMSC。穩(wěn)定傳代后,以光鏡形態(tài)學觀察,CD29、CD44、CD117流式細胞術,成骨、成脂誘導培養(yǎng)鑒定BMSC。結果:全骨髓貼壁培養(yǎng)法能獲得穩(wěn)定的BMSC,呈平行排列或漩渦狀生長。細胞呈梭形或多角型,CD29、CD44、CD117陽性表達率分別為99.94％、99.28%、1.35%,

12、誘導成骨、成脂分化成功。結論:全骨髓貼壁法能從小鼠骨髓中分離培養(yǎng)出均質性良好的BMSC。
　　 第三部分超聲微泡及雙特異性抗體增效骨髓間充質干細胞歸巢及干預心肌纖維化
　　 目的:探討骨髓間充質干細胞(BMSC)在BiAb和超聲輻射微泡(microbubble,MB)的輔助下歸巢并干預心肌纖維化的效果。方法:以CD29抗體(能識別間充質干細胞)和抗肌凝蛋白輕鏈抗體(AMLCA)(能特異性結合損傷心肌)制備BiAb(CD2

13、9×AMLCA)。將此BiAb與雄性小鼠BMSC輸入異丙腎性心肌纖維化雌性小鼠,輔以超聲輻照微泡(BMSC+BiAb+MB組)。另設單純BMSC組、單純BiAb組、單純MB組、BiAb+BMSC治療組、正常對照組、未治療組。5周后處死小鼠,熒光定量PCR檢測心肌Y染色體鑒別基因(sex-determining region ofY-Chromosome,SRY)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-

14、1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)的表達。天狼猩紅染色觀察膠原分布,western-blot觀測心臟信號轉導與轉錄激活因子1(signal transducer and activators oftranscription-1,STATl)和信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducerand activators of transcription-3,S

15、TAT3)的表達。結果: BMSC歸巢數最多的是BMSC+BiAb+MB組,其次為BMSC+BiAb組,BMSC組歸巢數最少。與未治療組相比,BMSC+BiAb+MB組、BMSC+BiAb組和單純BMCS組的心肌MMP-9、TIMP-1和STAT1表達下調,STAT3表達升高,膠原沉積降低(p＜0.05)。其中,與單純BMSC組相比,BMSC+BiAb+MB組的心肌STAT3表達明顯上調,TIMP-1明顯下調(p＜0.05)。結論:CD

16、29×AMLCA雙特異抗體可促進小鼠BMSC的歸巢,聯合超聲輻射微泡,可進一步增加干細胞的歸巢率和修復效果。BMSC歸巢后能改善缺血心肌MMP-TIMP表達,干預心肌纖維化,其機制可能與心肌STAT介導的信號通路有關。
　　 第四部分骨髓間充質干細胞干預心肌纖維化的可能機制
　　 目的:探討骨髓間充質干細胞(BMSC)移植干預心肌纖維化的可能機制。方法:分離培養(yǎng)雄性小鼠BMSC,經尾靜脈輸入異丙腎性心肌纖維化雌性小鼠(治

17、療組)。另設未治療組和正常對照組。5周后處死小鼠,免疫組織化學染色法觀察心臟核轉錄因子-κb(nuclear factor-κb,NF-κb)、核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和細胞凋亡蛋白酶(caspase-3)的表達,熒光定量PCR檢測心肌SRY、MMP-9、TIMP-1的表達,天狼猩紅染色觀察膠原分布。結果:與未治療組相比,治療組心肌有雄性BMSC歸巢,膠原沉積減少,NF

18、-κb、caspase-3表達下調,PCNA表達增加(p＜0.05)。結論: BMSC移植到纖維化心肌,能抑制NF-κb過度活化,改善心肌增殖-凋亡狀態(tài)。其干預機制與細胞因子網絡介導有關。
　　 第五部分 PⅢNP預測冠心病合并代謝綜合征患者近期心臟重塑程度及預后
　　 目的:探討血漿Ⅲ型前膠原氨基末端肽(PⅢNP)對冠心病合并代謝綜合征患者心血管重塑及預后的預測價值。方法:連續(xù)入選108例冠心病合并代謝綜合征患者(平均

19、年齡63.29±3.32歲,女性56%),放免法測定PⅢNP水平,檢測并隨訪1年后患者心臟、頸動脈彩超、6分鐘步行距離(6MWT)。根據PⅢNP的中位數水平(3.5μg/L)將受試者分為高低水平兩組,統(tǒng)計其各指標差異,多元逐步回歸分析影響PⅢNP的因素,并分析PⅢNP與心血管重塑程度的相關性,COX比例風險模型分析心腦血管事件再入院的預測因子,ROC曲線分析PⅢNP判斷再住院的閾值。結果:血漿PⅢNP水平與冠心病合并代謝綜合征患者年齡(

20、β=0.686,p＜0.001),高敏C反應蛋白(β=0.194,p=0.001),BMI(β=0.108,p=0.023)相關。與PⅢNP＜3.5μg/L組相比,PⅢNP≥3.5μg/L組患者的心律不齊發(fā)生率、1年內再住院率和左心室心肌重量指數(LVMI)明顯增加,6MWT縮短(p均＜0.05)。隨著Ln PⅢNP(r=0.271,p=0.007)升高,隨訪期間心臟重塑程度加重。COX比例風險模型顯示,PⅢNP、INEF、高敏C反應蛋