原發(fā)性膽汁性膽管炎模型鼠腹腔B細胞調(diào)節(jié)性功能機制探究.pdf

1、原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種自身免疫性肝臟疾病，它的典型特征是肝臟有大量淋巴細胞浸潤在膽管周圍，并且血清中有高滴度的由自身反應(yīng)性B細胞分泌的抗線粒體抗體AMAs。有很多因素參與到PBC的發(fā)病過程中，包括免疫失調(diào)、遺傳的易感性以及環(huán)境因素等。已有的研究指出B細胞在PBC的發(fā)病過程中的作用十分復(fù)雜，根據(jù)情況不同，可能發(fā)揮致病性作用或者免疫調(diào)節(jié)性功能。但是其具體機制尚不清楚，仍然需要進一步研究和探索。
　　B細胞是一類重要的免疫細

2、胞，主要分為2個亞群，即B1細胞（包含B1a細胞和B1b細胞）和B2細胞。這兩個B細胞亞群在前體細胞來源、發(fā)育途徑、組織分布、表型及功能等方面存在差異。在自身免疫性疾病發(fā)生過程中，一般認為B細胞通過分泌抗體發(fā)揮致病性作用。但最近的研究發(fā)現(xiàn)B細胞除了包含發(fā)揮致病性功能的亞群，同時還具有免疫調(diào)節(jié)性功能的亞群。調(diào)節(jié)性B細胞(Breg細胞)發(fā)揮功能的機制主要包括產(chǎn)生IL-10和TGF-β、參與次級抗原遞呈、與致病性T細胞相互作用以及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T

3、細胞（Treg細胞）的產(chǎn)生等。B1細胞是一個特殊的B細胞亞群，大量存在于腹腔及胸腔中，主要通過分泌天然抗體、作為抗原遞呈細胞以及分泌細胞因子來發(fā)揮免疫保護作用。B1細胞來源的天然抗體在細菌和病毒感染過程中發(fā)揮重要的保護作用。B1a細胞是腹腔B1細胞中的主要亞群，B1a細胞經(jīng)典的功能包括產(chǎn)生血清中靜息狀態(tài)的IgM、分泌腸道IgA以及發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能等。B1a細胞是抗炎性細胞因子IL-10的主要來源，并且在接觸性超敏反應(yīng)模型以及病理條件下能

4、夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)性功能。
　　為了更好的闡明B細胞亞群在PBC發(fā)病進程中的作用，我們以p40-/-IL-2Rα-/-小鼠以及被廣泛研究的dnTGF-βRⅡ小鼠作為PBC的模型鼠展開研究。本論文主要探究了p40-/-IL-2Rα-/-小鼠中腹腔B1a細胞的紊亂與自身免疫性膽管炎的關(guān)系，同時利用dnTGF-βRⅡ小鼠腹腔B細胞的共轉(zhuǎn)輸實驗對模型鼠中腹腔B細胞的免疫調(diào)節(jié)性功能進行驗證。目前取得的結(jié)果如下:
　　1.p40-/-IL-

5、2Rα-/-模型鼠腹腔微環(huán)境改變影響腹腔B細胞數(shù)目并與肝臟炎癥具有相關(guān)性
　　為了探究p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠肝臟損傷時腹腔微環(huán)境的變化，通過檢測腹腔中各細胞亞群數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)模型鼠中腹腔總細胞數(shù)目顯著增多，且增多的主要是T細胞，尤其是致病性的CD8+T細胞，而B細胞數(shù)目顯著減少。進一步研究表明模型鼠腹腔CD4+和CD8+T細胞分泌Th1型炎性細胞因子IFN-γ的能力顯著增強。通過檢測腹腔灌洗液中炎性細胞因子的水平，我

6、們發(fā)現(xiàn)促炎性細胞因子TNF和MCP-1水平顯著升高，這可能是導(dǎo)致腹腔各細胞亞群改變的原因。通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)模型鼠中腹腔總細胞數(shù)與肝臟單個核細胞數(shù)呈正相關(guān)，腹腔中B1a細胞占B細胞的比例與腹腔及肝臟單個核細胞數(shù)呈負相關(guān)，且腹腔中B1a細胞占B細胞的比例與腹腔及肝臟中致病性的CD8+T細胞的比例呈負相關(guān)。
　　2.p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠腹腔B1a細胞數(shù)目減少且功能性分子改變
　　通過對PBC模型鼠發(fā)病過程中腹腔

7、B細胞的詳細檢測，我們發(fā)現(xiàn)相比于對照鼠，模型鼠腹腔B1a及B1b細胞的比例和數(shù)目顯著降低，而且模型鼠腹腔B1a細胞的比例隨著年齡增長逐漸降低。進一步的機制研究表明模型鼠腹腔B1a細胞增殖能力顯著降低且凋亡水平顯著升高。模型鼠腹腔B1a細胞數(shù)目顯著減少的同時，與B1a細胞免疫調(diào)節(jié)性功能相關(guān)分子，包括IL-10，CTLA-4和GITR的表達水平都顯著下降;與B1a細胞活化及免疫共刺激相關(guān)分子CD44和CD80的表達水平明顯降低。通過對另一種

8、PBC模型鼠，即dnTGF-βRⅡ小鼠的表型檢測，我們發(fā)現(xiàn)與p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠類似，dnTGF-βRⅡ小鼠腹腔B1a細胞比例下降，且表達IL-10、CTLA-4、CD44和CD80的水平同樣顯著低于同窩對照鼠。
　　3.p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠腹腔B1a細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　為了全面探究p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠腹腔B1a細胞轉(zhuǎn)錄組變化及其內(nèi)在機制，利用基因芯片技術(shù)并配合熒光定量PCR

9、驗證，我們發(fā)現(xiàn)與對照鼠相比，模型鼠腹腔B1a細胞有381個基因發(fā)生了顯著變化（2倍以上差異），其中包含大量細胞因子及其受體相互作用相關(guān)、轉(zhuǎn)錄因子活化相關(guān)及細胞周期相關(guān)基因的變化。且多個與B細胞功能相關(guān)的基因都發(fā)生了顯著改變，其中具有免疫抑制性基序(ITIM)的分子CD72（Cd72）、CD22(Cd22)等表達顯著上升，與流式結(jié)果一致的Cd44、Ctla4等表達顯著下降，以及IL-10的上游抑制分子AHR(Ahr)等表達顯著上升。這些發(fā)

10、現(xiàn)詳細地展示了模型鼠與對照鼠腹腔B1a細胞存在的差異，揭示了B1a細胞異常在PBC發(fā)病過程中的重要作用機制，并提示了一些在人類PBC研究中值得參考的基因和信號通路。
　　4.PBC模型鼠腹腔B細胞對自身免疫性膽管炎治療潛力的評估
　　為了探討PBC模型鼠腹腔B細胞對膽管炎是否具有治療潛能，我們進一步利用過繼轉(zhuǎn)輸實驗發(fā)現(xiàn)單轉(zhuǎn)輸dnTGF-βRⅡ模型鼠脾臟CD8+T細胞能引起RAG1-/-受體鼠肝臟產(chǎn)生嚴重的淋巴細胞浸潤，而將d

11、nTGF-βRⅡ模型鼠腹腔B細胞或WT鼠腹腔B細胞與dnTGF-βRⅡ模型鼠脾臟CD8+T細胞共轉(zhuǎn)輸，發(fā)現(xiàn)RAG1-/-受體鼠肝臟淋巴細胞浸潤都有所減輕。該實驗為證明PBC模型鼠腹腔B細胞在炎性條件下具有強大的免疫調(diào)節(jié)功能提供了有利的證據(jù)。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)在炎性環(huán)境下，p40-/-IL-2Rα-/-模型鼠中腹腔B1a細胞顯著減少，且B1a細胞免疫調(diào)節(jié)性功能紊亂，分泌免疫調(diào)節(jié)性分子IL-10和表達CTLA-4的水平顯著降低，