角蛋白8參與原發(fā)性膽汁性肝硬化膽管上皮細胞凋亡、線粒體損傷及其信號傳導機制.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）是一種以肝內中小膽管進行性破壞為特征的自身免疫性膽汁淤積性肝臟疾病。約90％-95%的PBC患者可檢測到抗線粒體抗體（Anti-mitochondrial antibodies，AMA），線粒體何種成分失去免疫耐受引起PBC發(fā)病并不清楚。細胞凋亡時細胞膜損傷、卷曲以及外翻使細胞內容物外漏，線粒體成分降解清除障礙，產生免疫原性片段可能誘發(fā)了PBC。
　　

2、角蛋白（Cytokeratin，CK）是細胞骨架蛋白中間絲家族中數(shù)量最多和最重要的成員，不僅具有保護細胞、維持線粒體正常結構的功能，而且參與細胞生長、凋亡等重要生理病理過程。角蛋白缺失或異常表達與疾病密切相關。研究表明，過表達CK8會引發(fā)小鼠慢性胰腺炎；CK8-/-的小鼠會發(fā)生自發(fā)性結腸炎；乳腺癌中CK8的表達明顯上調。
　　近年來，有學者認為CK8缺失或表達異常同肝臟疾病發(fā)病相關。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟損傷時，CK8以及CK18 m

3、RNA和蛋白的表達量可升高3倍[8,29]。CK8-/-小鼠可出現(xiàn)慢性肝炎，肝細胞損傷、凋亡[30]，C57/B1 CK8-/-小鼠約94％胚胎期死亡并伴廣泛肝出血、肝損傷[31]，F(xiàn)VB／N CK8-/-小鼠55％有正常的生存期，但在基礎狀態(tài)時表現(xiàn)為輕微肝炎、肝巨噬細胞異常和肝細胞增生，予膠原酶灌注后出現(xiàn)明顯肝壞死，對凋亡誘導劑的敏感性明顯增加[9]。另外有研究報道，CK8表達異?？赡芡琍BC發(fā)病相關。PBC患者體內可檢測到抗CK8自

4、身抗體，PBC患者肝臟CK8/CK18的蛋白含量可升高2-4倍。國外研究也證實在PBC患者中CK8突變明顯升高，CK8缺失或表達異常與PBC的嚴重程度相關。動物實驗亦發(fā)現(xiàn)CK8-/-小鼠肝細胞線粒體形態(tài)、功能發(fā)生變化，且血清抗線粒體抗體（Anti-mitochondrial antibodies，AMA）陽性。以上研究提示：CK8缺失或異常表達可能參與PBC的發(fā)病，但是，CK8缺失或表達異常在PBC發(fā)病中扮演的角色并不清楚。
　　

5、本研究探討CK8是否通過影響線粒體功能誘導細胞凋亡參與PBC發(fā)病。
　　【目的】
　　1、研究過表達以及干擾CK8對人膽管細胞RBE凋亡的影響；
　　2、研究過表達以及干擾CK8對人膽管細胞RBE線粒體形態(tài)和功能的影響；
　　3、探討CK8表達異常通過何種信號通路介導細胞凋亡。
　　【方法】
　　1、構建CK8過表達以及干擾慢病毒載體，感染人膽管細胞RBE，建立CK8過表達以及干擾細胞系，采用RT-P

6、CR和Western Blot檢測人膽管細胞RBE中CK8的表達量；
　　2、采用免疫細胞化學實驗和流式細胞術分析過表達以及干擾CK8人膽管細胞RBE凋亡水平變化；
　　3、采用免疫細胞化學實驗和流式細胞術分析過表達以及干擾CK8人膽管細胞RBE線粒體的形態(tài)和功能的變化；
　　4、通過Western Blot實驗研究AKT信號通路在過表達以及干擾CK8凋亡中作用；5、采用免疫細胞化學實驗和流式細胞術分析GCDC作用對人

7、膽管細胞RBE凋亡的影響；
　　6、采用免疫細胞化學和流式細胞術分析GCDC作用對線粒體的形態(tài)和功能的變化；
　　7、通過Western Blot實驗研究AKT信號通路在GCDC作用后CK8表達異常的人膽管細胞RBE凋亡中作用；
　　【結果】
　　1、CK8表達異常促進人膽管細胞RBE凋亡
　　RT-PCR和Western Blot實驗結果顯示，過表達以及干擾CK8細胞角蛋白量發(fā)生相應改變。激光共聚焦實驗結

8、果顯示，過表達以及干擾CK8細胞角蛋白成團狀、且分布不均，細胞核固縮、碎裂。流式細胞術實驗結果顯示，過表達以及干擾CK8細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義。
　　2、CK8表達異常參與人膽管細胞RBE線粒體形態(tài)和功能變化
　　激光共聚焦實驗結果顯示，過表達以及干擾CK8細胞線粒體絲狀斷裂，分布不均。流式細胞術實驗結果顯示，過表達以及干擾CK8細胞的活性氧含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義。
　　3、CK8表達異常介導人膽

9、管細胞RBE AKT信號通路引起細胞凋亡
　　Western Blot結果顯示過表達或干擾CK8細胞AKT的磷酸化蛋白水平明顯下調，總蛋白水平無明顯變化；AKT下游的抑制凋亡相關蛋白Bcl-2表達明顯下調，抗凋亡蛋白Cleaved caspase-3明顯上調。
　　4、GCDC促進CK8表達異常人膽管細胞RBE角蛋白破壞、線粒體損傷以及細胞凋亡
　　激光共聚焦實驗結果顯示，GCDC作用細胞角蛋白成團狀、且分布不均，細胞