Calcein-AM檢測(cè)凋亡過(guò)程中線(xiàn)粒體膜通透性變化研究.pdf

1、第一部分：Calcein-AM檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡方法的確立 背景和目的：眾多研究均提示線(xiàn)粒體在控制細(xì)胞死亡中起重要作用，凋亡早期時(shí)線(xiàn)粒體膜通透性即可發(fā)生變化。已有學(xué)者報(bào)道，與Calcein-AM共同孵育的細(xì)胞，其線(xiàn)粒體基質(zhì)能被Calcein特異性熒光染色，而胞質(zhì)中的Calcein熒光可被Co2+猝滅。此種特異性陽(yáng)性染色要求線(xiàn)粒體內(nèi)膜功能(通透性)完整，以便作為屏障將胞漿內(nèi)Co2+與線(xiàn)粒體基質(zhì)內(nèi)的Calcein隔開(kāi)。本實(shí)驗(yàn)旨在利用此

2、原理建立一種新的檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的方法并論證其可行性。 方法：將人類(lèi)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株(Molt-4)與Calcein-AM及Cocl2共同孵育染色，再經(jīng)喜樹(shù)堿(CPT)、紫外線(xiàn)(UV)誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)Calcein熒光(FL1)的變化。 結(jié)果：(1)不同凋亡誘導(dǎo)方式下，誘導(dǎo)后培養(yǎng)一定時(shí)間，Calcein熒光(FL1)低信號(hào)區(qū)域均比相應(yīng)對(duì)照增多；(2)同種誘導(dǎo)方式下，隨著誘導(dǎo)后培

3、養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Calcein熒光(FL1)低信號(hào)區(qū)域逐漸增多；(3)同種誘導(dǎo)方式及誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間下，隨著誘導(dǎo)因素強(qiáng)度的增加，Calcein熒光(FL1)低信號(hào)區(qū)域增多。 結(jié)論：Calcein-AM可以作為一種敏感的活細(xì)胞染料，用于流式細(xì)胞術(shù)中檢測(cè)早期凋亡。 第二部分：Calcein-AM和AnnexinV用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期凋亡敏感性的比較 目的：比較Calcein-AM與AnnexinV用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)活細(xì)

4、胞早期凋亡時(shí)的敏感性，以建立一種新的檢測(cè)早期凋亡的方法。 方法：將人類(lèi)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株(Molt-4)經(jīng)喜樹(shù)堿(CPT)、紫外線(xiàn)(UV)誘導(dǎo)后，分別采用Calcein-AM及異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(AnnexinV)進(jìn)行標(biāo)記，然后用流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡率，通過(guò)比較凋亡誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率來(lái)分析Calcein-AM和AnnexinV對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的敏感性。 結(jié)果：在喜樹(shù)堿誘導(dǎo)模型中，加藥后2小時(shí)即