大鼠肝臟再生時線粒體通透性轉(zhuǎn)換與蛋白釋放關(guān)系的研究.pdf

1、創(chuàng)傷和各種肝病后，殘存肝組織很快會進(jìn)入復(fù)雜的再生過程。研究肝再生分子機(jī)理必將對肝臟移植、創(chuàng)傷、各種肝病及肝腫瘤診治具有重要意義。但是目前對肝再生的分子機(jī)理，尤其是肝再生啟動和終止的機(jī)制仍不清楚。而能量代謝的調(diào)控始終是肝細(xì)胞再生過程中的重要環(huán)節(jié)，線粒體不僅為細(xì)胞生命活動提供所需的能量，而且直接參與細(xì)胞內(nèi)許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。許多研究表明線粒體通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrialpermeabilitytransition,MPT)是這一切功

2、能的重要環(huán)節(jié)，與細(xì)胞許多生命活動(增殖、腫瘤、凋亡、損傷和衰老等)有關(guān)。 近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)肝再生過程中尤其是在早期(0-24h)MPT有一些明顯特征性的變化。GrecoM等在1998年發(fā)現(xiàn)一些線粒體基質(zhì)酶不同程度的釋放到胞液中，GuerrieriF等在2002年發(fā)現(xiàn)早期線粒體的超微結(jié)構(gòu)顯著變化，我們課題組在2004年通過離體實驗發(fā)現(xiàn)在肝再生的早期和后期線粒體的通透性均明顯增加。而這些變化與肝再生的關(guān)系如何目前還不清楚，尤其是

3、與肝再生的啟動和終止的關(guān)系目前還沒有進(jìn)一步的研究。鑒于上述分析，本課題利用經(jīng)典的大鼠肝再生模型(partialhepatectomy，PH)，并用線粒體通透性轉(zhuǎn)換的專一性抑制劑環(huán)胞菌素A(cyclosporin-A，CsA)干擾和影響肝再生過程，觀察肝再生情況和在體線粒體超微結(jié)構(gòu)變化，系統(tǒng)研究肝再生過程中MPT的變化及其功能意義，包括自由基、線粒體基質(zhì)蛋白釋放以及細(xì)胞凋亡的變化，并用蛋白組學(xué)的方法研究肝再生早期線粒體的蛋白質(zhì)釋放譜，為更

4、好的闡明肝細(xì)胞再生的分子機(jī)理提供實驗依據(jù)。 一、肝再生過程中肝再生情況和線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化為了在體觀察肝再生過程中線粒體通透性轉(zhuǎn)換的變化規(guī)律，我們觀察了肝再生度和再生指數(shù)的變化，在體線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化以及CsA對其的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PH后24h時肝臟的體積和體質(zhì)量開始有明顯的變化，然后逐漸升高，到168h時達(dá)到峰值，而CsA組在PH后72h時的肝再生度和再生指數(shù)明顯低于PH組，其他時間兩組之間無顯著差別。 透射電鏡顯

5、示在PH后24h時線粒體發(fā)生重度腫脹，線粒體明顯增大變圓，基質(zhì)變淡，甚至完全空泡化，嵴明顯縮短甚至消失；72h時中度腫脹，6h、120h時輕度腫脹，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也有類似的變化；0h、3h、168h時基本正常。CsA組在0、3、6h時輕度腫脹，24h中度腫脹，72h和168h時則明顯收縮，早期線粒體的腫脹可能與CsA對肝臟的毒性作用有關(guān)，后期的收縮可能與CsA對線粒體的通透性轉(zhuǎn)換抑制有關(guān)。 二、肝再生過程中自由基含量的時相變化活性氧族

6、與抗氧化系統(tǒng)在細(xì)胞再生和分化過程中具有重要調(diào)控作用，同時自由基與MPT是互為因果關(guān)系。我們測定了肝再生過程中肝組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)的變化，發(fā)現(xiàn)在PH后3h時輕度升高，到24h時達(dá)到最高，之后逐漸下降，到120h時恢復(fù)正常。CsA組MDA的變化規(guī)律與PH組的基本一致，但在(0-120h)的各個時間點自由基含量明顯高于PH組。 三、肝再生過程中線粒體和胞液中AST和GDH酶活性的時相變化上述線粒體超

7、微結(jié)構(gòu)的改變是否會伴有線粒體蛋白的釋放?我們系統(tǒng)研究了肝再生過程中線粒體基質(zhì)蛋白天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase，AST)和谷氨酸脫氫酶(glutamicaciddehydrogenase，GDH)的酶活性，以及CsA對其的影響。發(fā)現(xiàn)胞液中的mAST和GDH在PH后3h升高，到24h時都達(dá)到最高峰，到120h恢復(fù)正常，同時線粒體內(nèi)的這兩種酶活性則相應(yīng)降低。CsA組在0h和3h時胞液中的這兩種酶活性顯著高

8、于PH組，在24h、48h和72h時則顯著低于PH組，后期恢復(fù)正常。肝再生過程中這兩種線粒體基質(zhì)酶的釋放情況與線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律基本一致，暗示了肝再生過程中線粒體通透性轉(zhuǎn)化與蛋白質(zhì)釋放相關(guān)。 四、肝再生過程中肝caspase-3和caspase-8活性的時相變化為了進(jìn)一步研究肝再生過程中細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律和探討肝細(xì)胞凋亡活性的變化與MPT之間的關(guān)系，我們測定了肝再生過程中肝細(xì)胞凋亡蛋白酶caspase-3和caspase-

9、8活性變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PH組3h和6h時caspase-3活性在出現(xiàn)短暫性的升高，到72h顯著性升高，到168h時升高最明顯；在CsA組，caspase-3活性在3h時達(dá)到峰值，顯著高于PH組，之后逐漸下降，而后期(72-168h)則顯著低于PH組，但仍高于SH組。caspase-8活性在0h時CsA組顯著高于PH組和SH組，在3h時三個組都同時升高，但CsA組顯著高于PH組和SH組，在168h時PH組顯著高于CsA組和SH組，其他時間

10、三組無顯著差異。表明肝再生早期細(xì)胞凋亡活性的升高可能與術(shù)后應(yīng)激和外源性途徑激活有關(guān)，而后期的明顯升高可能與線粒體途徑有關(guān)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。 五、肝再生過程中線粒體的釋放蛋白圖譜本課題研究和其他研究都表明在PH后24h時線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化和基質(zhì)蛋白釋放最明顯，但線粒體釋放的哪些蛋白仍不清楚。我們用肝再生24h和SH組的肝組織分離的線粒體進(jìn)行體外孵育，用二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)，研究了線粒體蛋白釋放的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在二維電泳凝

11、膠中共有60個左右的蛋白質(zhì)點，選定了3個明顯差異的蛋白質(zhì)作質(zhì)譜分析，分別為：鈣網(wǎng)硬蛋白、精氨酸酶I和一個預(yù)測蛋白Tpr(translocatedpromoterregion)。Tpr的功能目前不清楚，其余2個都與肝細(xì)胞的蛋白質(zhì)和DNA合成增加有關(guān)。 結(jié)論1、肝再生過程中線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化與肝再生的發(fā)生和發(fā)展有一定的相關(guān)性，尤其在24h時變化最顯著，此時肝臟的體積和體質(zhì)量開始顯著增加，這種變化可能與肝再生的啟動有密切關(guān)。

12、 2、肝再生過程中自由基變化和線粒體基質(zhì)蛋白釋放與線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律基本一致，提示自由基變化和線粒體基質(zhì)蛋白釋放可能與MPT相關(guān)。 3、肝再生過程中早期細(xì)胞凋亡活性的短暫性升高可能與術(shù)后應(yīng)激反應(yīng)和外源性途徑有關(guān)，而后期的顯著升高可能與線粒體途徑有關(guān)。 4、CsA在體介入影響肝再生過程，進(jìn)一步佐證上述變化與MPT相關(guān)。 5、在PH后24h時肝組織線粒體體外誘導(dǎo)后的上清，經(jīng)過雙向電泳和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)3種明顯差異