血糖波動(dòng)誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換在非酒精性脂肪肝肝細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種無(wú)過(guò)量飲酒史，但病理學(xué)改變類(lèi)似酒精性脂肪肝，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床綜合征。臨床研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病(T2DM)患者發(fā)生NAFLD風(fēng)險(xiǎn)增加，且糖尿病患者更易從單純性非酒精性脂肪肝進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及肝纖維化，但機(jī)制不明。氧化應(yīng)激和肝細(xì)胞凋亡是NAFLD進(jìn)展的核心環(huán)節(jié)，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致炎癥因子釋放增多，多種促凋亡因子表達(dá)增強(qiáng)，肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、凋亡或壞死，使病程向NASH及肝纖

2、維化進(jìn)展。而線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)是調(diào)控細(xì)胞凋亡的“生命閘門(mén)”。
　　血糖波動(dòng)異常是糖代謝紊亂的重要標(biāo)志之一。多項(xiàng)臨床研究表明，血糖波動(dòng)指數(shù)升高是引起脂質(zhì)過(guò)氧化物水平升高的最主要因素，改善血糖水平或減少血糖波動(dòng)幅度都有助于減少氧化應(yīng)激引起的損害。那么在T2DM患者中，糖尿病是否可能通過(guò)波動(dòng)性高血糖的形式誘發(fā)氧化應(yīng)激促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)NAFLD的進(jìn)展呢？
　　本研究擬建立肝細(xì)胞脂肪變性模型和糖尿病合并NAFLD小鼠模型

3、，并在體內(nèi)外模擬血糖波動(dòng)，以透射電鏡技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL技術(shù)、病理染色、熒光探針及蛋白免疫印跡等技術(shù)，觀察波動(dòng)性高血糖對(duì)肝細(xì)胞凋亡、肝組織炎癥性壞死以及纖維化的作用;并探討波動(dòng)性高糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激是否通過(guò)誘導(dǎo)MPT發(fā)生損傷線粒體形態(tài)和呼吸鏈功能，并啟動(dòng)細(xì)胞色素C介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，以期能揭示糖尿病促進(jìn)NAFLD進(jìn)展的機(jī)制。
　　第一部分非酒精性脂肪肝小鼠模型中血糖波動(dòng)對(duì)于肝細(xì)胞的凋亡的作用研究
　　

4、目的:
　　建立2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠模型，體內(nèi)模擬血糖波動(dòng)，觀察波動(dòng)性高血糖(IHG)對(duì)肝組織壞死性炎癥、纖維化和肝細(xì)胞凋亡的作用，并探討IHG誘發(fā)的氧化應(yīng)激是否通過(guò)損傷線粒體功能，并啟動(dòng)細(xì)胞色素C(Cyt c)介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡。
　　方法:
　　利用高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠建立T2DM合并NAFLD小鼠模型，并通過(guò)每日2次腹腔葡萄糖注射(3g

5、/kg)或同體積生理鹽水(NS)注射建立高脂飲食波動(dòng)性高血糖（HFD+F）和持續(xù)性高血糖小鼠模型（HFD+NS）。首先監(jiān)測(cè)對(duì)照組小鼠（普通飼料喂養(yǎng)并NS注射，STD+NS）、HFD+NS組和HFD+F組小鼠體重、血糖、胰島素及肝酶譜改變;其次，利用病理染色觀察IHG對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)沉積、肝臟纖維化，肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響，再者，利用TUNEL和WesternBlotting技術(shù)觀察IHG對(duì)于肝細(xì)胞凋亡的影響，最后，利用Western B

6、lotting及生化法觀察IHG對(duì)于線粒體功能，如Cytc的釋放、ATP的產(chǎn)生的影響。
　　結(jié)果:
　　1.HFD喂養(yǎng)較普通飲食(STD)喂養(yǎng)可顯著增加小鼠體重、誘導(dǎo)糖耐量異常、胰島素抵抗，并增加肝臟脂質(zhì)沉積、肝酶水平以及肝臟纖維化(P＜0.01)。但上述指標(biāo)在HFD+F與HFD+NS小鼠間并無(wú)差異(P＞0.05)。
　　2.HFD喂養(yǎng)較STD喂養(yǎng)可增加小鼠肝細(xì)胞凋亡比率及凋亡相關(guān)蛋白，如Bax、Cleaved cas

7、pase9和Cleaved caspase3的表達(dá)(P＜0.01)，而HFD+F小鼠肝細(xì)胞凋亡水平顯著高于HFD+NS小鼠(P＜0.01)。
　　3.HFD喂養(yǎng)較STD喂養(yǎng)可增加小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化水平，丙二醛(MDA)、壬烯（HNE）含量顯著升高(P＜0.01)，而IHG可進(jìn)一步升高小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化水平(P＜0.05 vs.HFD+NS)。
　　4.HFD+NS小鼠較STD+NS小鼠胞漿Cyt c含量及肝臟ATP產(chǎn)生顯著升高(P＜

8、0.01)，HFD+F組小鼠胞漿Cyt c含量進(jìn)一步更高(P＜0.01)，而肝臟ATP合成則較HFD+NS下降(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.HFD喂養(yǎng)的小鼠糖耐量、胰島素敏感性、肝臟脂質(zhì)沉積、肝酶水平、肝臟纖維化程度、肝細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)過(guò)氧化水平如MDA、HNE含量、線粒體Cyt c釋放及ATP產(chǎn)生較STD喂養(yǎng)小鼠明顯增加。
　　2.盡管予HFD喂養(yǎng)小鼠IHG后，小鼠糖耐量、胰島素敏感性、肝臟脂質(zhì)沉積、肝酶水平

9、以及肝臟纖維化程度上與單純HFD喂養(yǎng)小鼠比較并無(wú)差異，但I(xiàn)HG小鼠肝細(xì)胞凋亡，脂質(zhì)過(guò)氧化水平，以及線粒體Cyt c釋放明顯增高，而ATP的產(chǎn)生下降。表明在T2DM伴NAFLD的小鼠模型中，IHG可通過(guò)增加肝臟氧化應(yīng)激水平、能量合成障礙、線粒體功能受損而增加肝細(xì)胞凋亡，而IHG增加肝細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制有待體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。
　　第二部分血糖波動(dòng)誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換促進(jìn)脂肪變性肝細(xì)胞凋亡的作用研究
　　目的:
　　建立肝

10、細(xì)胞脂肪變性模型，并在體外模擬血糖波動(dòng)。觀察波動(dòng)性高糖(IHG)對(duì)棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的作用;并探討IHG誘發(fā)的氧化應(yīng)激是否通過(guò)誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)發(fā)揮作用。
　　方法:
　　L02細(xì)胞分別用:①正常血糖組（NG，10％ FBS1640培養(yǎng)液+葡萄糖5.5mmol/l）;②正常血糖脂肪變性組（NG+P，10％ FBS1640培養(yǎng)液+0.125mM棕櫚酸）;③持續(xù)高糖組（SHG，10％ FBS1640培養(yǎng)液+

11、葡萄糖30.0mmol/l）;④持續(xù)高糖脂肪變性組（SHG+P，10％ FBS1640培養(yǎng)液+0.125mM棕櫚酸）;⑤波動(dòng)性高糖組（IHG，10％ FBS1640培養(yǎng)液+葡萄糖5.5mmol/l和30.0mmol/l，每間隔12h更換1次）;⑥波動(dòng)性高糖脂肪變性組（IHG+P，10％ FBS1640培養(yǎng)液+0.125mM棕櫚酸+葡萄糖5.5mmol/l和30.0mmol/l，每間隔12h更換1次）培養(yǎng)72h。利用油紅染色及熒光探針觀察

12、細(xì)胞脂肪變性情況，利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)和Western blotting檢測(cè)L02細(xì)胞凋亡、ROS產(chǎn)生，線粒體膜電位（△ψm）及細(xì)胞色素C(Cyt c)釋放情況，并利用電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。予環(huán)孢霉素A(CsA)抑制MPT，觀察關(guān)閉MPT孔是否能逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激及凋亡。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過(guò)72h培養(yǎng)，PA處理組L02細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增加，但不同糖濃度間脂滴數(shù)量和大小并無(wú)顯著差異。
　　2.在PA存在時(shí)，與NG

13、組比較，SHG可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡比率及凋亡相關(guān)蛋白，如Cleaved caspase9、Cleaved caspase3及Cleaved PARP表達(dá)增加(P＜0.05)，而IHG可進(jìn)一步惡化肝細(xì)胞凋亡（P＜0.05 vs.SHG+P組）;但單純SHG或IHG對(duì)L02細(xì)胞凋亡并無(wú)誘導(dǎo)作用(P＞0.05)。
　　3.在PA存在時(shí)，與NG組比較，SHG處理后ROS產(chǎn)生及線粒體氧化應(yīng)激增加(P＜0.05)，且IHG較SHG更易誘發(fā)氧化應(yīng)激

14、(P＜0.05);但單純SHG或IHG對(duì)L02細(xì)胞ROS產(chǎn)生及線粒體氧化應(yīng)激并無(wú)明顯誘導(dǎo)作用(P＞0.05)。
　　4.SHG+P組較NG+P組電鏡下線粒體微結(jié)構(gòu)異常（線粒體內(nèi)嵴減少、基質(zhì)腫脹并出現(xiàn)空泡），提示MPT孔開(kāi)放;肝細(xì)胞線粒體功能障礙更為顯著，表現(xiàn)為△ψm下降、線粒體Cyt c釋放增加、而IHG+P對(duì)線粒體形態(tài)和功能損傷作用較SHG更強(qiáng)。但在不存在PA時(shí)，不同糖濃度對(duì)線粒體功能無(wú)明顯影響。
　　5.予CsA預(yù)處理關(guān)