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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:長(zhǎng)期以來糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids,GCs)作為重要抗炎藥物用于炎癥性肺病(inflammatory lung disease,ILD)的治療。ILD是由于炎癥、免疫等各種因素導(dǎo)致肺及支氣管內(nèi)大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),釋放大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生瀑布級(jí)聯(lián),進(jìn)而引起肺內(nèi)炎性介質(zhì)和抗炎介質(zhì)失衡造成的肺臟疾病。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),可以通過刺激機(jī)體各種免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞炎性介質(zhì)
2、,進(jìn)而誘發(fā)ILD。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages,AMs)是LPS的主要效應(yīng)細(xì)胞,釋放內(nèi)源性炎癥因子產(chǎn)生瀑布級(jí)聯(lián)是導(dǎo)致炎癥發(fā)生、發(fā)展的根本原因。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活子-3(Signal transducers and activators of transcription-3,STAT3)的激活在調(diào)控ILD起著關(guān)鍵的作用。抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAP
3、K)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能減少致炎癥細(xì)胞因子的釋放。本實(shí)驗(yàn)以小鼠AM為研究對(duì)象,觀察激素與p38MAPK特異性抑制劑SB203580對(duì)LPS刺激的上述細(xì)胞分泌TNF-α、IL-10的影響,分析兩者是否存在協(xié)同作用并進(jìn)一步探討STAT信號(hào)途徑在其中的作用,為臨床應(yīng)用激素及p38MAPK抑制劑治療ILD提供理論基礎(chǔ)。
方法:
1.ELISA檢測(cè)LPS刺激細(xì)胞上清液中的TNF-α濃度。培養(yǎng)MH-S細(xì)胞株,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到1×106/
4、ml,于24孔板中培養(yǎng)過夜,隨機(jī)分組:①對(duì)照組:加入與各實(shí)驗(yàn)組體積相同的無血清RPMI1640培養(yǎng)液;②LPS+Dex組:終濃度為1×10-6mol/L的DEX預(yù)孵育2h后LPS刺激2h、6h、12h;③Dex組:終濃度為1×10-6mol/L的DEX刺激2h、6h、12h;④Dex+SB203580+LPS組:終濃度為1×10-6mol/L的DEX預(yù)孵育2h后,終濃度為10μmol/L的SB203580預(yù)孵育20 min后LPS刺激2
5、h、6h、12h;⑤LPS+SB203580組:終濃度為10μmol/L的SB203580預(yù)孵育20 min后LPS刺激2h、6h、12h;⑥LPS組:終濃度為100ng/ml的LPS刺激2h、6h、12h。
各組細(xì)胞刺激成功后取上清液,ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF-α的含量。
2.ELISA檢測(cè)LPS刺激細(xì)胞上清液中的IL-10濃度。方法及分組同TNF-α測(cè)定。
3.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)MH-S細(xì)胞中p
6、-STAT3的表達(dá)。將MH-S細(xì)胞于24孔板中進(jìn)行爬片,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到1×106/ml,培養(yǎng)過夜,隨機(jī)分組:①對(duì)照組:加入與各實(shí)驗(yàn)組體積相同的無血清RPMI1640培養(yǎng)液;②LPS+Dex組:終濃度為1×10-6mol/L的DEX預(yù)孵育2h后,LPS刺激30min;③Dex組:終濃度為1×10-6mol/L的DEX刺激30min;④Dex+SB203580+LPS組:終濃度為1×10-6mol/L的DEX預(yù)孵育2h后,終濃度為10μmo
7、l/L的SB203580預(yù)孵育20 min后,LPS刺激30min;⑤LPS+SB203580組:終濃度為10μmol/L的SB203580預(yù)孵育20 min后,LPS刺激30min;⑥LPS組:終濃度為100ng/ml的LPS刺激30min。各組MH-S細(xì)胞刺激成功后,用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞中的p-STAT3表達(dá)變化。
4.Western blot方法檢測(cè)MH-S細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、STAT3的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組同免疫細(xì)
8、胞化學(xué)法,于6孔板中上述各組細(xì)胞刺激成功后收集細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、STAT3表達(dá)。
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,各組比較用單因素方差分析(Oneway ANOVA),各組之間進(jìn)一步用Student-Newman-Keuls(SNK-q)檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較分析是否有顯著性差異,P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1.細(xì)胞上清液中TNF-α含量的變化:LPS刺激MH-S細(xì)胞后,細(xì)胞上清液中
9、TNF-α含量在2h已經(jīng)開始升高,6h達(dá)高峰,12h稍下降,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DEX預(yù)處理后,抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α增加,與LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);SB203580預(yù)處理后,抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α增加,與LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DEX和SB203580共同預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用,進(jìn)一步抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α增
10、加,與DEX+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與SB+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.細(xì)胞上清液中IL-10含量的變化:LPS刺激MH-S細(xì)胞后,細(xì)胞上清液中IL-10含量在2h已經(jīng)開始升高,6h達(dá)高峰,12h已經(jīng)開始下降,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DEX預(yù)處理后,抑制LPS誘導(dǎo)的IL-10增加,與LPS組在2h、6h、12
11、h分別比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);SB203580預(yù)處理后,抑制LPS誘導(dǎo)的IL-10增加,與LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DEX和SB203580共同預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用,進(jìn)一步抑制LPS誘導(dǎo)的IL-10增加,與DEX+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與SB+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3.免
12、疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明:對(duì)照組細(xì)胞僅見微弱黃染;LPS刺激30min后細(xì)胞黃染最強(qiáng);用DEX預(yù)處理后,LPS刺激引起的細(xì)胞黃染減弱;用SB203580預(yù)處理后,LPS刺激引起的細(xì)胞黃染減弱;用DEX和SB203580預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用,LPS刺激引起的細(xì)胞黃染進(jìn)一步減弱;用DEX預(yù)處理后,未給予LPS刺激細(xì)胞微弱黃染。各組與對(duì)照組比較p-STAT3表達(dá)均顯著增高(P<0.05);與LPS組比較,DEX+LPS組、SB+LPS組、DEX+S
13、B+LPS組p-STAT3表達(dá)均顯著減少(P<0.05);與DEX+LPS組、SB+LPS組比較,DEX+SB+LPS組p-STAT3表達(dá)進(jìn)一步減少(P<0.05)。
4.Western-blot檢測(cè)p-STAT3結(jié)果表明:對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)p-STAT3微量表達(dá);LPS刺激30min后細(xì)胞內(nèi)p-STAT3表達(dá)最強(qiáng);用DEX預(yù)處理后,LPS刺激引起的細(xì)胞內(nèi)p-STAT3表達(dá)減弱;用SB203580預(yù)處理后,LPS刺激引起的細(xì)胞內(nèi)p-
14、STAT3表達(dá)減弱;用DEX和SB203580預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用,LPS刺激引起的細(xì)胞內(nèi)p-STAT3表達(dá)進(jìn)一步減弱;用DEX預(yù)處理后,未給予LPS刺激細(xì)胞內(nèi)p-STAT3表達(dá)微弱。各組與對(duì)照組比較p-STAT3表達(dá)均顯著增高(P<0.05);與LPS組比較,DEX+LPS組、SB+LPS組、DEX+SB+LPS組p-STAT3表達(dá)均顯著減少(P<0.05);與DEX+LPS組、SB+LPS組比較,DEX+SB+LPS組p-STAT3
15、表達(dá)進(jìn)一步減少(P<0.05)。
5.Western-blot檢測(cè)STAT3結(jié)果表明:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)非磷酸化STAT3表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異(P>0.05)。
結(jié)論:
1.LPS可引起MH-S細(xì)胞上清液中的TNF-α和IL-10分泌增加,用DEX、SB203580分別干預(yù)后,可抑制TNF-α、IL-10分泌,DEX和SB203580協(xié)同抑制TNF-α、IL-10分泌。結(jié)果提示p38MAPK抑制劑SB2035
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