巴西蘇木素對T24細胞的毒性效應(yīng)及數(shù)字基因表達譜分析.pdf

1、巴西蘇木素是從蘇木中提取的一種有效成分，已有研究表明，巴西蘇木素具有抗腫瘤活性，但其殺傷腫瘤細胞的機制并不清楚。本文通過MTT法和流式細胞儀分析了巴西蘇木素對人類移行膀胱癌T24細胞的毒性效應(yīng)，進一步基于大規(guī)模的表達譜測序分析，探討了巴西蘇木素殺傷腫瘤細胞的作用機制，結(jié)果為新藥靶的發(fā)現(xiàn)及抗癌藥物的研發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 一、巴西蘇木素對人類移行膀胱癌T24細胞的毒性效應(yīng)
　　 用不同濃度的

2、巴西蘇木素處理T24細胞，MTT法檢測受損傷細胞的比例，發(fā)現(xiàn)毒性效應(yīng)隨濃度增加而提高，在64μg/mL時進入平臺期，計算獲得半數(shù)致死濃度(LC50)為32μg/mL;用LC50劑量處理T24細胞，在不同時間點檢測細胞受損傷的程度，發(fā)現(xiàn)隨著巴西蘇木素處理時間的延長，毒性效應(yīng)也隨之增強。結(jié)果表明:巴西蘇木素對T24細胞的毒性有劑量依賴和時間依賴效應(yīng)。進一步采用流式細胞儀檢測巴西蘇木素對T24細胞凋亡及周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巴西蘇木素對細胞有

3、較強的毒性作用，處理后活細胞數(shù)目明顯減少，同時也發(fā)現(xiàn)，巴西蘇木素可誘導T24細胞在G2期阻滯。
　　 二、數(shù)字基因表達譜分析及差異表達基因篩選
　　 隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字基因表達譜使得我們能快速、準確、經(jīng)濟的檢測樣本中基因轉(zhuǎn)錄水平。我們采用數(shù)字基因表達譜系統(tǒng)檢測巴西蘇木素處理前后基因表達水平的變化。
　　 選取32μg/ml的巴西蘇木素處理T24細胞6h，生理鹽水處理作為對照，提取mRNA后進行數(shù)字基因

4、表達譜分析，結(jié)果表明:521個基因出現(xiàn)上調(diào)，968個基因出現(xiàn)下調(diào)。對差異表達基因進行歸類分析，發(fā)現(xiàn)與細胞凋亡相關(guān)的基因有17個發(fā)生了顯著變化，與細胞周期相關(guān)的基因有21個發(fā)生了顯著變化。結(jié)合GO及pathway分析，篩選差異表達基因，共篩選出17個與細胞毒性相關(guān)的基因。
　　 三、采用Real-timePCR技術(shù)對差異表達基因進行驗證分析
　　 采用Real-timePCR技術(shù)對篩選出的17個與細胞毒性相關(guān)的基因進行驗證

5、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Caspase家族中的Caspase3，Caspase8，Caspase9mRNA水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化，CycD、CycE、CDK2、CDK4、CDK6的mRNA水平均沒有發(fā)生顯著變化。在與死亡受體介導的細胞凋亡通路中TRADD高表達，與對照組有顯著差異，F(xiàn)ADD、FAS表達沒有發(fā)生顯著變化。熱休克蛋白家族中HSP40、HSP70A在巴西蘇木素處理3h和6h后表達顯著上調(diào)，HSP70B在處理3h，6h，12h后表達都顯著上調(diào)

6、。HSP47在處理后mRNA水平?jīng)]有顯著變化。c-Fos在處理3h，12h后表達顯著上調(diào)，6h極顯著，和對照組相比上調(diào)32倍。因此，我們選取變化顯著的c-Fos進行深入研究。
　　 四、差異表達基因c-Fos的功能研究
　　 Real-timePCR結(jié)果顯示:巴西蘇木素處理T24細胞6h后，c-FosmRNA水平表達顯著上調(diào)。進一步采用westernblot檢測c-Fos蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)巴西蘇木素處理6h后，c-Fo

7、s蛋白水平表達上調(diào)。為了研究c-Fos在巴西蘇木素細胞毒性中的作用，構(gòu)建超表達載體，與載體EGFP-N1共轉(zhuǎn)染T24細胞，檢測c-FosmRNA及蛋白水平的變化。結(jié)果顯示，c-FosmRNA及蛋白水平都顯著上調(diào)。進一步觀察超表達后對腫瘤細胞的影響，發(fā)現(xiàn)c-Fos超表達后腫瘤細胞形態(tài)發(fā)生變化，細胞變圓，結(jié)構(gòu)松散，透光性降低，貼壁性變差，同時，細胞數(shù)目也顯著減少。采用MTT法檢測c-Fos超表達后細胞活性變化，結(jié)果表明，與空載體轉(zhuǎn)染的對照組