羊肚菌多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和抗腫瘤機(jī)制的研究.pdf

1、近年來，人們對(duì)多糖類物質(zhì)的研究逐漸成為新熱點(diǎn)，同時(shí)對(duì)其分離純化技術(shù)、結(jié)構(gòu)分析及活性物質(zhì)的研究也日益深入。研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌多糖具有抗菌、抗腫瘤、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力等多種活性，但對(duì)于其具體作用機(jī)制現(xiàn)在仍有待進(jìn)一步深入研究。本課題側(cè)重于羊肚菌多糖結(jié)構(gòu)和抗腫瘤機(jī)理的研究，弄清多糖的這些分子特征，能深入了解它們的結(jié)構(gòu)與活性之間的構(gòu)效關(guān)系及生物活性作用機(jī)理，為多糖在藥物領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)中首先用響應(yīng)面法對(duì)培

2、養(yǎng)過程中影響多糖產(chǎn)率的各種條件進(jìn)行優(yōu)化避免對(duì)材料和資源的浪費(fèi)；繼而對(duì)提取純化出的羊肚菌多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行闡述；最后對(duì)多糖作用于HepG2細(xì)胞后通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抑制這一機(jī)制途徑進(jìn)行研究。
　　 (1)響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件：以羊肚菌GIM5.69為研究對(duì)象，首先對(duì)影響羊肚菌發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖MEP的諸多外界因素進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，篩選出主要影響因素；然后采取響應(yīng)面法，用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)

3、驗(yàn)探尋各影響因素的最佳水平。結(jié)果：羊肚菌胞外多糖的最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為，蔗糖3.98％，養(yǎng)時(shí)間5.98d，轉(zhuǎn)速217.44r/min。此條件下的驗(yàn)證試驗(yàn)表明，此時(shí)胞外多糖的得率為53.04％，與理論值基本吻合，誤差僅為1.64％。
　　 (2)多糖提取采取水提醇沉的方法獲得后，通過Sevage法除去蛋白；然后經(jīng)DEAE-SepharoseF·F離子交換柱分離，并用NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，分別收集后苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量，得

4、到兩種羊肚菌多糖成分MEP-I和MEP-Ⅱ，再經(jīng)過AKTASuperdex-200柱層析進(jìn)一步分離純化。MEP-I和MEP-rI兩種成分的分子量大小是通過HPLC/ELSD色譜分析得到，通過紅外FT-IR和色譜HPLC/ELSD分別測(cè)出這兩種成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和分子量大小。結(jié)果如下：MEP-I，MEP-II分子量為3.91×103和1.58×105Da，兩種成分均由甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glu)組成，但兩者的摩爾比不同

5、，其中葡萄糖的含量最大，摩爾比分別達(dá)到84.64％和78.39％，其次還含有阿拉伯糖(Ara)和鼠李糖(Rha)。并通過并間羥聯(lián)苯法測(cè)定其成分中含有少量糖醛酸。紅外光譜結(jié)果表明兩種成分還具有羧基的特征吸收峰，這與理化性質(zhì)所測(cè)的結(jié)果是一致的。掃描電鏡觀察到羊肚菌多糖的外部形貌，多糖是由很多呈球狀或圈狀形貌的固體顆粒，這些球狀和圈狀的結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步連接或側(cè)向聚集成鏈狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
　　 (3)MTT法確定羊肚菌多糖MEP對(duì)HeLa、H

6、epG2及AS49三種腫瘤細(xì)胞的抑制率大小，選取一種效果最為明顯的腫瘤細(xì)胞HepG2細(xì)胞進(jìn)行以下的研究。首先形態(tài)學(xué)方面觀察細(xì)胞的凋亡情況，通過熒光顯微鏡和透射電鏡觀察羊肚菌多糖MEP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞的變化情況，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有明顯的凋亡特征。同時(shí)為了研究細(xì)胞凋亡過程中一些因子的變化情況解釋細(xì)胞發(fā)生凋亡的途徑，實(shí)驗(yàn)采用不同濃度羊肚菌多糖作用HepG2細(xì)胞后，通過AnnexinV-FITC/PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，羊肚菌多糖可以