小鼠脾貼壁型細(xì)胞分離傳代培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究.pdf

1、小鼠脾細(xì)胞在免疫學(xué)研究中應(yīng)用非常廣泛，其原代培養(yǎng)技術(shù)成熟，絕大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道與免疫細(xì)胞的研究有關(guān)；而貼壁型的小鼠脾細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及生物學(xué)特性未見相關(guān)研究報(bào)道。本論文的主要目的是建立小鼠貼壁型脾細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，初步探索小鼠貼壁型脾細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　在小鼠貼壁型脾細(xì)胞的傳代過程中，發(fā)現(xiàn)小鼠脾細(xì)胞的代次越高，細(xì)胞生長速度則越快；細(xì)胞代次逐漸增高后，優(yōu)勢細(xì)胞逐漸富集，無法貼壁、半貼壁或生長緩慢的細(xì)胞而逐漸減少,而細(xì)胞形態(tài)逐漸趨向于

2、呈統(tǒng)一的多邊形。代次越高的細(xì)胞，其培養(yǎng)時(shí)間越短，從60 d（F1代）變?yōu)? d（F50代）；細(xì)胞傳代比例越大，F(xiàn)1-F10代細(xì)胞比例為1：1，而F41-F50代細(xì)胞比例為1：3。脾細(xì)胞生長特性越來越接近哺乳動(dòng)物的其它傳代細(xì)胞系。
　　通過生化分析細(xì)胞培養(yǎng)液上清的AST、γ-GT、UA、LD、LDH等含量，發(fā)現(xiàn)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液上清中γ-GT、LD、LDH的濃度隨著細(xì)胞代次的增高而先升后降，如傳代后第1d的含量（或活力）變化趨勢分別為

3、：γ-GT從16.744 mmol/L（F1代）升高到17.442 mmol/L（F20代），后下降到6.047 mmol/L（F50代）；LD從0.269 mmol/L（F1代）升高到0.491 mmol/L（F10代），后下降到0.115 mmol/L（F50代）；LDH從2022.186 U/L（F1代）升高到2961.225 U/L（F10代），后下降到1464.097 U/L（F50代）；AST和UA的濃度（或活力）隨著細(xì)胞代

4、次的增加而升高，如傳代后第1d，AST的活力從3.140 U/L（F1代）升高到11.116 U/L（F50代），UA的含量從2.327 mmol/L（F1代）升高到3.125 mmol/L（F50代）。
　　采用PCR和ELISA方法分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平分析小鼠貼壁型脾細(xì)胞分泌IL-5、IL-18、IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β、TNF-γ、GM-CSF等細(xì)胞因子的情況。實(shí)驗(yàn)表明小鼠貼壁型脾傳代細(xì)胞培養(yǎng)

5、液上清中IL-18、TNF-γ及GM-CSF的含量隨著細(xì)胞代次的增加而逐漸降低，IFN-α、IFN-β、TNF-α及TNF-β的含量隨著細(xì)胞代次的增加而先升后降，其含量的變化趨勢分別為：IL-5從0.083 mmol/L（F1代）升高到0.173 mmol/L（F20代），后下降到0.035 mmol/L（F50代）；IL-18從1.236 mmol/L（F1代）下降到0.023 mmol/L（F50代）；IFN-α從0.301 mmo

6、l/L（F1代）升高到0.336 mmol/L（F10代），后下降到0.033 mmol/L（F50代）；IFN-β從0.094 mmol/L（F1代）升高到0.300 mmol/L（F10代），后下降到0.001 mmol/L（F50代）；TNF-α從1.009 mmol/L（F1代）升高到1.034 mmol/L（F10代），后下降到0.134 mmol/L（F50代）；TNF-β從1.180 mmol/L（F1代）升高到1.257

7、 mmol/L（F10代），后下降到0.335mmol/L（F50代）；TNF-γ從1.155 mmol/L（F1代）下降到0.266 mmol/L（F50代）；GM-CSF從0.469 mmol/L（F1代）下降到0.335 mmol/L（F50代）。
　　同時(shí)，低代次細(xì)胞培養(yǎng)上清液（F1、F2、F10、F20、F30代）對(duì)Marc-145細(xì)胞繁殖PRRSV和Vero細(xì)胞繁殖PRV產(chǎn)生明顯的抑制作用；而PRV能在高代次小鼠脾細(xì)胞