高糖刺激大鼠系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)Ⅳ型膠原生成的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病全身性微小血管病變的腎臟特征性表現(xiàn)，是糖尿病患者的主要死亡原因之一，也是引起終末腎病(end stage renal disease，ESRD)的主要原因之一。其基本的病理改變是系膜細(xì)胞的增生及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)成分產(chǎn)生增加。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未明確，然而，氧化應(yīng)激和炎癥損傷被廣泛認(rèn)為是DN的重要機(jī)制，也被我們的

2、前期實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。
　　氧化應(yīng)激己被認(rèn)為是DN發(fā)生發(fā)展的共同通路。盡管內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)合成的一氧化氮(nitric oxide，NO)，有保護(hù)腎臟的作用。但DM時(shí)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)合成過量的NO與O2-?？裳杆侔l(fā)生反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite，ONOO-

3、)，導(dǎo)致廣泛的氧化應(yīng)激損傷，參與DN的發(fā)病與進(jìn)展。而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)轉(zhuǎn)基因通過減少ONOO-的生成，起到防治DN的作用。我們的前期研究也表明iNOS選擇性抑制劑氨基胍和ONOO-清除劑尿酸鹽(Urate)可顯著延緩DN的發(fā)生與進(jìn)展，提示氧化應(yīng)激是DN發(fā)生的關(guān)鍵。
　　炎癥反應(yīng)同樣在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。作為主要炎癥介質(zhì)的PGE2的合成主要受環(huán)氧化酶(cyclooxygenas

4、e，COX)的調(diào)節(jié)。COX-1基因具有調(diào)節(jié)機(jī)體生理平衡，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。COX-2基因在炎癥刺激和其它類型組織損傷時(shí)可被誘導(dǎo)，表達(dá)明顯增加。我們前期的研究表明，COX-2與iNOS共同促進(jìn)了DN的發(fā)生發(fā)展。前列環(huán)素(Prostacyclin，PGI2)可拮抗PGE2等的致炎效應(yīng)，而PGI2生成的關(guān)鍵酶前列環(huán)素合酶(prostacyclin synthase，PGIS)，在炎癥反應(yīng)中起著重要的平衡作用。
　　亦有研究表明，內(nèi)皮

5、功能異常在糖尿病血管病變的發(fā)病中也起到關(guān)鍵作用。內(nèi)皮細(xì)胞損傷參與了DN發(fā)生發(fā)展的全過程。絕大多數(shù)內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是由腎小球的血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的，在腎臟具有廣泛的生物活性。ET是目前所知的最強(qiáng)的長(zhǎng)效縮血管活性肽，能產(chǎn)生持續(xù)的縮血管效應(yīng)，在與血管病變有關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。ET的活性受內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶(endothelin converting enzyme，ECE)調(diào)節(jié)，DM時(shí)ECE活性的上調(diào)可

6、導(dǎo)致ET升高。
　　在DM時(shí)，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、腎素.血管緊張素系統(tǒng)活性增加等共同參與DN的發(fā)生發(fā)展，他們可通過參與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)途徑的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致ECM積聚及腎小球硬化。TGF-β1主要通過Smad2、Smad3和Smad4蛋白傳遞信號(hào)，啟動(dòng)腎小球基質(zhì)的主要成份Ⅳ型膠原基因轉(zhuǎn)錄。Ⅳ型膠原分子由3條α肽鏈組成，目前分離得到的單肽鏈依其一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，可分為α1(

7、Ⅳ)型膠原鏈[簡(jiǎn)寫為α1(Ⅳ)]和α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)、α6(Ⅳ)六條。Ⅳ型膠原大分子α鏈有特定的組織分布。DN時(shí)，TGF-β1通路主要經(jīng)由Smad3激活Ⅳ型膠原基因轉(zhuǎn)錄，而Smad3敲除，可使糖尿病小鼠腎皮質(zhì)Ⅳ型膠原的α1鏈不表達(dá)。
　　雖然已有研究表明，高糖刺激早期即可引起氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等的損傷性反應(yīng)，但是在大鼠系膜細(xì)胞中，相關(guān)酶譜的變化，尚未有報(bào)道。而高糖刺激大鼠系膜細(xì)胞所引起的早期反應(yīng)，是否可

8、激活的TGF-β通路，從而導(dǎo)致Ⅳ型膠原的大量生成，尚未有系統(tǒng)研究。
　　本實(shí)驗(yàn)采用高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，采用RT-PCR的方法檢測(cè)早期氧化應(yīng)激關(guān)鍵酶eNOS、iNOS、SOD，炎癥關(guān)鍵酶COX-1、COX-2和PGIS及ECE的表達(dá)譜，以探討高糖刺激早期，相關(guān)酶譜的表達(dá)變化；RT-PCR檢測(cè)高糖誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)，大鼠腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，同時(shí)利用免疫熒光染色法動(dòng)態(tài)觀察大鼠腎小球系膜細(xì)胞中Sma

9、d3的核轉(zhuǎn)位情況，旨在探討高糖誘導(dǎo)早期反應(yīng)激活TGF-β/Smads信號(hào)通路的情況；RT-PCR檢測(cè)高糖誘導(dǎo)，大鼠腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1下游基因Ⅳ型膠原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)各鏈的表達(dá)，旨在探討在高糖環(huán)境下，TGF-β1通路激活Ⅳ型膠原基因各α鏈的表達(dá)情況。
　　方法：
　　1培養(yǎng)細(xì)胞
　　傳代培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞接種于六孔板，10％胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞換液

10、，無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞同步化，細(xì)胞換液，10％胎牛血清高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。在高糖DMEM培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)，終止培養(yǎng)，用于檢測(cè)。
　　2總RNA的提取：Trizol法提取細(xì)胞總RNA。
　　3 RT-PCR檢測(cè)：采用RT-PCR的方法檢測(cè)氧化應(yīng)激關(guān)鍵酶eNOS、iNOS、SOD，炎癥關(guān)鍵酶COX-1、COX-2、PGIS，ECE、細(xì)胞因子TGF-β1及其下游基因Ⅳ型膠原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α

11、4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)各鏈的表達(dá)。
　　4免疫熒光染色法觀察Smad3的核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)果：
　　1氧化應(yīng)激相關(guān)的關(guān)鍵酶iNOS的表達(dá)在高糖刺激1小時(shí)時(shí)明顯升高；eNOS表達(dá)量無變化；SOD的表達(dá)在刺激后明顯降低。
　　2炎癥反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵酶COX-2在高糖刺激0-3小時(shí)內(nèi)呈表達(dá)量逐漸升高的趨勢(shì)；COX-1、PGIS表達(dá)量無變化。
　　3在0-3小時(shí)內(nèi)，ECE mRNA隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸增強(qiáng)。

12、>　　4 TGF-β1的表達(dá)具有時(shí)間依賴性，3小時(shí)開始明顯增強(qiáng)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5 Smad3在高糖刺激80分鐘開始有進(jìn)核跡象，一直持續(xù)至180分鐘。
　　6Ⅳ型膠原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α5(Ⅳ)鏈mRNA表達(dá)，在6小時(shí)時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰，延長(zhǎng)至48小時(shí)其變化不大；α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)鏈mRNA無明顯表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1高糖刺激大鼠系膜細(xì)胞早期(0-3h)，氧化應(yīng)激關(guān)鍵酶iNOS、炎癥反應(yīng)關(guān)鍵酶